一、ABC 法（SP、LSAB、SABC法步驟相同）
ABC(avidin-biotin comeplex)卵白素-生物素複合物法屬於親和免疫組織化學技術，根據卵白素-生物素高親和力的生物學特性，用生物素與過氧化物酶結合獲得生物素過氧化物酶，再加入卵白素和生物素形成卵白素-生物素-過氧化物酶複合物。而LSAB、S-P、SABC是以抗生物素蛋白鏈酶素代替卵白素，用標記了過氧化物酶的抗生物素蛋白鏈酶素（SA）代替ABC複合物，步驟相同，但由於SA分子量較小，穿透性較好，反應速度較快。並且SA有兩個和生物素親和力極高的結合點，其本身沒有連線生物素，可以與二抗上的生物素連結，比ABC更容易與二抗上的生物素結合，故敏感性高，複合物也不需要使用前混合，更為簡單方便。ABC為三步法，第二抗體為生物素化的IgG（或IgM、IgA等），其中的Fab片段與第一抗體結合，這就要求與第一抗體相配對，如第一抗體是鼠抗，第二抗體應該為抗鼠的（或IgM、IgA等）；如第二抗體是兔抗，第二抗體應該為抗兔的（或IgM、IgA等），還有羊、大鼠、馬等來源的抗體。如果使用了鼠兔通用型二抗，那當一抗是鼠或兔時就不必再分了。由於卵白素和生物素親和力強，故ABC較PAP敏感20-40倍。最後通過複合物上的過氧化物酶與顯色反應形成有顏色的沉澱物，可用顯微鏡觀察。過氧化物酶最好的顯色劑為DAB，形成不溶於水的棕色顆粒，可用酒精脫水、二甲苯透明；如用AEC顯色，生成溶於水的紅色沉澱，故不能脫水，只能用水溶性封片劑封固，不利於長期儲存。
步驟：
1、切片脫蠟至水
2、阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室
溫20分鐘。水洗。
3、抗原修復：（1）pH7.2 TBS 緩衝液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分鐘。或（2）按說明書要求：蒸餾水洗，放入抗原修復液（Ph6.0）內微波修復20分鐘、或電爐加熱30分鐘、或高壓鍋加帽出氣後3分鐘，快速冷卻；或(3) 按說明書要求：不處理）
4、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。
6、甩去多餘血清，加一抗37 ℃，30分鐘。，
7、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
8、滴加二抗，37 ℃，30分鐘。
9、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
10、滴加ABC複合物，37 ℃，45分鐘。
11、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
12、DAB顯色3～10分鐘。
13、水洗。
14、蘇木素淡染，藍化，脫水，透明，封固。
二、PAP法
步驟：
1、切片脫蠟至水
2、阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室
溫20分鐘。水洗。
3、抗原修復：（1）pH7.2 TBS 緩衝液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分鐘。或（2）按說明書要求：蒸餾水洗，放入抗原修復液（Ph6.0）內微波修復20分鐘、或電爐加熱30分鐘、或高壓鍋加帽出氣後3分鐘，快速冷卻；或(3) 按說明書要求：不處理）
4、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。
6、甩去多餘血清，滴加特異性抗體37℃30―60分鐘或4℃過夜，置溼盒中。
7、PBS洗。
8、滴加二抗，37 ℃，30分鐘。
9、 pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
10、加PAP抗體37℃ 30分鐘。
11、pH7.2 TBS緩衝液洗三次，DAB顯色3～10分鐘。
12、水洗。
13、蘇木素淡染，藍化，脫水，透明，封固。
三、APAAP法
APAAP：屬於非標記抗體法，通過具有高特異性的抗鹼性磷酸酶抗體，並在抗酶抗體中加入大量的鹼性磷酸酶，使鹼性磷酸酶充分結合在抗酶抗體上，形成可溶性的APAAP複合物，常用的顯色劑為BCIP/NBT、固紅或固藍。特點不會與內源性過氧化物酶反應，所以背景較為乾淨，特別適合內源性過氧化物酶較多的組織，如肝、腎。
步驟：
1、切片脫蠟至水（冰凍切片或細胞塗片用PBS浸泡3分鐘，不需抗原修復）
2、阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室
溫20分鐘。水洗。
3、抗原修復：（1）pH7.2 TBS 緩衝液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分鐘。或（2）按說明書要求：蒸餾水洗，放入抗原修復液（Ph6.0）內微波修復20分鐘、或電爐加熱30分鐘、或高壓鍋加帽出氣後3分鐘，快速冷卻；或(3) 按說明書要求：不處理）
4、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。
6、甩去多餘血清，適當稀釋的特異性抗體，37℃ 60分鐘，或4℃過夜。
7、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。
8、橋抗體，37℃ 40分鐘或室溫1小時。
9、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。
10、滴加適當稀釋的APAAP複合物，37℃30分鐘。
11、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。
12、滴加AKP底物溶液，37℃ 15――30分鐘，陽性結果顯現清晰後流水沖洗。
13、復染（核固紅或蘇木素或甲基綠）1―2分鐘，常規沖洗後，甘油明膠封片。
四、 LDP（labelled dextran polymer）法（Envision 二步法）
酶標聚合物法，應用了酶標聚合物技術，如EnVison檢測系統，採用了辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶標記在葡萄糖聚合物上，再與二抗連線，形成EnVison二抗；象PowerVision檢測系統，採用了辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶標記在氨基酸片段上。由於聚合物上超過20個以上的位點能與一抗結合，聚合物上的酶數量也較多，故較ABC、LSAB等方法更為敏感。最為重要的是，由於LDP系統二抗上沒有生物素的存在，不會出現ABC、S-P等方法中出現的與內源性生物素結合的交叉反應，減少了非特異性著色，背景更為乾淨。
步驟：
1、切片脫蠟至水
2、0.3％H2O2甲醇液：阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室溫20分鐘。自來水洗。
3、抗原修復：（1）pH7.2 TBS緩衝液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分鐘。或（2）按說明書要求：蒸餾水洗，放入抗原修復液（Ph6.0）內微波修復20分鐘、或電爐加熱30分鐘、或高壓鍋加帽出氣後3分鐘，快速冷卻；或(3) 按說明書要求：不處理）
4、pH7.2 PBS緩衝液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃，20分鐘。
6、甩去多餘血清，加一抗，37 ℃，30分鐘。
7、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
8、滴加Envision二抗，37 ℃，30分鐘。
9、pH7.2 TBS 緩衝液洗三次。
10、DAB顯色3～10分鐘。
11、水洗。
12、蘇木素淡染，藍化，脫水，透明，封固。
五、雙重染色法
1、切片脫蠟至水
2、阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室溫
20分鐘。 水洗。
3、抗原修復：（1）pH7.2 TBS緩衝液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分鐘。或（2）按說明書要求：蒸餾水洗，放入抗原修復液（Ph6.0）內微波修復20分鐘、或電爐加熱30分鐘、或高壓鍋加帽出氣後3分鐘，快速冷卻；或(3) 按說明書要求：不處理）
4、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。（可不用）
6、甩去多餘血清，加一抗37 ℃，30分鐘。
7、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
8、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分鐘。
9、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
10、滴加ABC或S-P複合物（辣根過氧化物酶），37 ℃，45分鐘。
11、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
12、DAB（棕色）或AEC（紅色）顯色3～10分鐘。
13、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
14、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。（可不用）
15、甩去多餘血清，加第二種一抗37 ℃，30分鐘。
16、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
17、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分鐘。
18、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
19、滴加鹼性磷酸酶複合物，37 ℃，30分鐘。
20、pH7.2 TBS緩衝液洗三次。
21、BCIP/NBT顯色（藍色）
22、水洗
23、甲基綠復染，脫水，透明，封固。
如果選擇辣根過氧化物酶可選擇DAB（棕色）顯色，在第21步用辣根過氧化物酶複合物，第23步用AEC（紅色）顯色，但要注意的是AEC不能長期儲存。如選擇另一個為鹼性磷酸酶可選用BCI/NBT、AP-Red、AP-Orange，用BCI/NBT顯色最好。
六、免疫金法（IGS）
（1）切片常規脫蠟入水。
（2）用0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 10-30分鐘。
（3）雙蒸水洗2次。
（4）0.05 mol/L TBS PH7.4 洗10分鐘。
（5）1％卵蛋白封閉10分鐘。
（6）滴加特異性一抗，室溫2小時或4℃過夜。
（7）0.5 mol/L TBS PH7.4洗3次。
（8）1％ 卵蛋白封閉10分鐘。
（9）稀釋金標抗體37℃ 45分鐘。。
（9）0.05 mol/L TBS PH7.4洗3次。
（10）雙蒸水洗2次。
（11）1％戌二醛10分鐘。
（12）雙蒸水洗3次。
（13）復染、甘油封片、觀察。
結果：膠體金結合部位呈紅色。
七、免疫金銀法（IGSS）
（1）切片常規脫蠟入水。
（2）經含汞固定液固定的組織切片需經0.5％碘酒精脫汞,然後入0.5％硫代硫酸納水溶液脫碘,流水沖洗,雙蒸水洗乾淨， 0.05 mol/L TBS PH7.4液洗。
（3）用0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 10-30分鐘。
（4）0.05 mol/L TBS PH7.4液洗。
（5）1％ 卵蛋白封閉10分鐘。
（6）滴加適當稀釋的特異性抗體37℃ 1-2小時或4℃過夜。
（7）0.05mol/L TBS PH7.4 液洗3次。
（8）1％ 卵蛋白封閉10分鐘。
（9）滴加適當稀釋的金標記抗體室溫下37℃45分鐘。
（10）0.05 mol/L TBS PH7.2 液洗3次。
（11）蒸餾水洗2次，雙蒸水洗2次。
（12）入銀顯影液中3―5分鐘,反應過程需避光。
（13）蒸餾水洗。
（14）自來水沖洗，蘇木素淡復染。
（15）脫水、透明、封片、觀察。
結果：特異性抗體結合部位呈灰黑色顆粒，背景呈清灰色，核呈淡藍色。
試劑配製：
銀顯影液：
1、硝酸銀顯影液：
（1）10％阿拉伯膠水溶液60ml，檸檬酸緩衝液pH3.510ml
（2）對苯二酚1.7g加雙蒸水30ml。
（3）硝酸銀40mg加雙蒸水2ml。
（1）和（2）兩液完全溶解混合，臨用前加（3），暗處顯影。
2、0.05 mol/L TBS (pH7.4)：
Tris 12.1g,
NaCl 17.5g,
雙蒸水1900ml,充分攪拌溶解,用濃HCl調pH為7.4,再加雙蒸水至2000ml
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