吳漢青 王博 朱世凱 張建軍 王春友 吳河水*
【摘要】目的 檢測TLR9在人胰腺癌及胰腺癌細胞中的表達，研究CPG ODN2216對Panc-1細胞生物學行為的影響，並探討其臨床意義。方法 通過免疫組織化學方法確認TLR9蛋白在胰腺癌組織中的高表達，免疫熒光確認其在胰腺癌細胞株Panc-1中的高表達。通過細胞粘附、劃痕實驗、侵襲實驗、細胞克隆及MTT增值實驗，研究CPG ODN2216對細胞粘附力、活動力及增殖力的影響。結果 人胰腺癌標本及人胰腺癌細胞株Panc-1均高表達TLR9。劃痕實驗、體外粘附實驗、基質膠侵襲實驗、細胞克隆實驗證明CPG ODN2216實驗組細胞粘附力及活動力明顯低於未加序列對照組。MTT法檢測序列組增殖力明顯低於未加序列對照組，且增值活性具有時間劑量依賴性。結論TLR9基因與人類胰腺癌的侵襲轉移潛能相關，外源配體CPG ODN2216的使用可明顯抑制人類胰腺癌細胞Panc-1的侵襲、遷移能力。武漢協和醫院急診科吳漢青
【關鍵詞】CPG ODN2216, 胰腺腫瘤, Toll樣受體9,細胞生物學
Influence of CPG ODN down-regulation on biology of pancreas cell line PANC-1 and the expression of TLR9 in human pancreatic cancer
Han-Qing Wu, Bo Wang, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Chun-You Wang, He-Shui Wu
Department of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,China
Correspondence to: Professor He-Shui Wu, Email:[email protected].
[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer and investigate the effect of CPG ODN2216 on biological behavior of the pancreatic cell carcinoma, and to explore their clinical significance. Methods:
The immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 protein in the pancreatic cancer tissue and immunofluorescence staining was also performed to detect the TLR9 protein expression in pancreatic carcinoma cells．In vitro cell adhesion, Wound-healing scrape assay, transwell invasion assay and cell colony formation assay were performed to assess the effect of CPG ODN2216 on the invasive properties of Panc-1 cells. Results: The TLR9 were high expressed in the pancreatic cancer tissue and pancreatic carcinoma cells. In vitro experiments as cell spreading assays、cell adhesion、colony formation assay and invasion assays showed the cell adhesion and cell motility properties of CPG ODN 2216 group were apparently weakened compared with the
Control group. The MTT assay showed cell proliferation ability in the CPG ODN group was notably decrease, and CPG ODN2216 had inhibitive effects on growth of panc-1 cells in a dose and time-dependent manner.Conclusions:TLR9 gene is correlated with the invasive and metastatic potential of pancreatic carcinoma, and used of CPG ODN2216 induces the inhibition of migration and invasion of Panc-1 cell line.
[Key Words] CPG ODN2216; Pancreatic neoplasms; Toll-like receptor 9;Oncogenesis
近來發現toll樣受體可能參與多種惡性腫瘤的發生、發展過程[1]。而TLR9為該家族重要成員，能夠刺激B細胞和樹突狀細胞分泌大量的細胞因子和趨化因子，如白介素(IL)-12、IL-6、干擾素-γ、單核細胞抑制蛋白和金屬基質蛋白酶的表達[2]。很多腫瘤都出現TLR9高表達現象，為了研究TLR9基因在胰腺癌發生過程中所起的作用，在證實其在胰腺癌中高表達後，我們採用TLR9的特異性配體人工合成的寡脫氧核甘酸2216（CPG ODN2216）刺激胰腺癌細胞Panc-1,觀察胰腺癌細胞的生長增殖、成瘤能力和侵襲能力等惡性表性方面的變化，驗證TLR9基因在胰腺癌細胞發生和生長中所起的作用，為進一步研究TLR9基因的具體作用機制提供資訊。
1. 材料與方法
一、 實驗材料
1. 細胞：人胰腺癌細胞Panc-1由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院普外實驗室提供，Panc-1用含10％胎牛血清、100μmoL/ml青鏈黴素的DMEM高糖培養液在5％CO2、37℃條件下培養。2. 組織切片：30例人新鮮胰腺癌組織及相應的癌旁組織（據腫瘤邊緣1-2cm）取自胰腺癌患者，10例正常胰腺組織標本取自其他原因需行胰腺部分切除的非腫瘤患者，所有標本均為華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科中心接受手術治療的胰腺癌患者且經術後病理證實。3. 主要試劑: CpG-ODN2216（序列GGGGGACGATCGTCGGGGGG），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，全硫代磷酸化修飾，PAGE純化；TLR9單克隆抗體(cell signaling公司)。免疫組化及熒光試劑盒（武漢博士德公司）。Transwell小室（Coring公司）。Matrigel膠（Sigma公司）； MTT與DMSO（sigma公司）。二、 實驗方法
1. 免疫細胞熒光化學：用胰酶消化胰腺癌Panc-1細胞製成單細胞懸液，將單細胞懸液滴到玻片上。根據細胞生長狀態，24小時或更長時間適時取出爬片。PBS漂洗三次，每次5min，用4%的多聚甲醛固定15min；PBS漂洗三次，用0.5%Triton穿孔20min；PBS漂洗三次，用5%BSA封閉30min；甩幹液體後，直接加入稀釋的一抗，對照組用PBS代替一抗。於4℃孵育過夜；PBS漂洗三次，加入稀釋的二抗，於37℃孵育1h；PBS漂洗三次，加入稀釋的SABC-FITC，於37℃孵育30min；PBS漂洗三次，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。
2. 免疫組織化學：石蠟切片脫蠟後，酒精水化。3％過氧化氫室溫下浸泡10 min。切片在0.01moL枸櫞酸鹽緩衝液(pH6.0)中抗原修復。用5％山羊血清BSA室溫封閉30 min，棄封閉液。加入適當稀釋的一抗，對照組用PBS代替一抗，4℃過夜。PBS漂洗3遍，每遍5min；加生物素標記的二抗室溫孵育30 min，PBS洗3遍；加入SABC，室溫孵育30min。PBS清洗後DAB染色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察結果。
3. 二苯基溴化四氮唑藍(MTT)法檢測胰腺癌細胞的增殖：將消化的胰腺癌細胞懸液按1×103/孔接種於96孔培養板中，每孔100μl。37℃、5％CO2及飽和溼度條件下培養，24h細胞貼壁後，用不同濃度(0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)的CPG ODN2216作用細胞Panc-1,分別於培養後24h、48h、72h，加入濃度為5mg/ml的MTT20μl；培養4 h，棄上清，加入二甲基亞碸，150μl/孔，震動混勻，用酶標儀，在波長490nm處測定A值。抑制率=(A對照組-A藥物組)/A對照組×100％[3]。繪增殖抑制曲線，測半數抑制濃度(IC50)。
4. 劃痕實驗：將細胞濃度2×105/ml的Panc-1細胞懸液按每孔3ml加入6孔板，培養24h或更長時間，細胞生長達80％滿後，棄培養液，加入濃度分別為1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216的培養液，繼續培養24h。棄上清，採用細胞刮刀在孔中央對細胞作一劃痕，沿劃痕邊緣等距離間隔作4個標記作為資料測定點，測量時取平均值。PBS輕洗；加濃度分別為1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216培養液繼續培養，每6小時觀察1次，測量各個時間點的劃痕兩側細胞間的距離。
5. 細胞黏附實驗：96孔板鋪膠，風乾，BSA封阻，孵育60 min；將對照組及實驗組(CPG ODN 1μg/ml、10μg/ml兩種濃度干擾24 h)細胞濃度調整為(5×105)/ml，接種200μL/孔，孵育1h，PBS洗滌，加入濃度為5mg/ml MTT，培養4h；棄培養液，DMSO溶解20min；在波長490nm處測定A值；細胞黏附抑制率(％)=(A對照組-A藥物組)/A對照組×100％。每組細胞設三個副孔，取平均值。
6. 細胞侵襲實驗：在Transwell上室膜上室側加入30μL人工基底膜膠並風乾，分別加入200μL（含1×105個細胞）飢餓培養24h的細胞，調整CPG ODN的濃度為1μg/ml、10μg/ml。在侵襲小室下室加500μL含10%FBS作為趨化因子的DMEM培養基，置37℃、5%CO2中培養。24h後取出小室，用棉籤擦去上室中未轉移的細胞和多餘液體。將小室用4%多聚甲醛中固定10min，然後用1%結晶紫染色30min。去離子水充分洗膜。顯微鏡下觀察並計數。每組細胞設三個副孔，取平均值。
7. 細胞克隆實驗：用胰酶消化Panc-1細胞，吹打製成單細胞懸液，接種於6孔板，約200個/孔，設為不加CPG組和濃度分別為1μg/ml、10μg/ml的CPG組，每組細胞設2個復孔。將接種好的細胞於培養箱中繼續培養到14 d。肉眼見到可見細胞克隆體後終止培養，去除培養液，PBS洗滌，蘇木素染色30 min，PBS洗滌，計數細胞克隆形成率，數碼照相照相。實驗重複3次。
8. 統計學分析：實驗資料經SPSS13.0軟體分析，所有資料用平均數±標準差表示，對各組實驗資料之間差異是否有統計學意義進行t檢驗，P
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