大血管併發症是糖尿病的重要併發症，血管內皮功能紊亂是動脈硬化的早期病理生理階段，在大血管併發症的發生、發展中起著關鍵作用，氧化應激是動脈硬化發生的機制之一。
內皮祖細胞(EPCs) 是一類定居於骨髓，可特異性歸巢於血管內皮受損區域，並能分化增殖為成熟內皮細胞的一群幹/祖細胞，在血管損傷或組織缺血的情況下 , 存在於骨髓中的EPCs可以應答於區域性釋放的生長因子和細胞因子，動員至外周血液迴圈，特異性的歸巢於損傷或缺血部位，進一步增殖、分化為成熟的內皮細胞，參與血管新生和再內皮化。
Fadini GP等對糖調節受損和T2DM人群的EPCs進行研究表明，在糖調節受損人群，也就是糖尿病的前期，已經存在EPCs數量的減少，表明EPCs的下降伴隨於糖尿病的自然病程，他認為糖尿病前期心血管危險因素的增加不僅與高血糖及伴發的其他代謝異常導致的內皮損傷有關，而且與迴圈祖細胞耗竭引起的內皮再生障礙有關，迴圈祖細胞的下降導致了心血管危險因素的聚集。氧化應激是引起EPCs下降的影響因素之一。
2型糖尿病具有家族聚集性，其子女是糖尿病的高危發病人群，我們的前期研究表明，在糖耐量正常的2型糖尿病患者子女已經出現血管內皮功能障礙。那麼在這部分人群是否存在 EPCs數量的改變、氧化應激是否存在，他們之間的關係又是如何呢?目前這方面的研究較少。
本研究通過檢測2型糖尿病(T2DM)患者及其一級親屬(FDRs)的內皮依賴性血管舒張功能(FMD)、迴圈EPCs數量、血清氧化物、抗氧化物的變化, 並探討它們之間的關係，以期為預防和治療T2DM及其大血管併發症的發生、發展提供依據。
資料與方法
一、研究物件
選擇2008-2009年我院門診及住院糖耐量試驗(OGTT)確診的2型糖尿病患者作為糖尿病組共40例，男22例，女18例，年齡(44.78±1.82)歲，所有受試者均符合1999年WHO 2型糖尿病診斷標準，均不伴有糖尿病視網膜病變、神經病變及腎臟病變。
選擇2型糖尿病患者的子女作為FDRs組，共38例，男20例，女18例，年齡(46.87±1.91)歲，均排除空腹血糖受損、糖耐量受損和糖尿病;正常對照(NC)組 30例，男17例，女13例，年齡(44.07±1.89)歲，無糖尿病家族史。所有受試者經心電圖、超聲、血、尿、便檢查均於正常範圍，均排除高血壓、冠心病、腦血管病及周圍血管疾病，無肝、腎功能障礙，排除服用影響機體代謝的藥物，排除應用胰島素治療者。
二、方法
1、血生化指標測定：血糖的測定採用葡萄糖氧化酶法，HBAlc測定採用化學法;血脂(膽固醇、甘油三酯)測定應用酶法測定，採用美國BeckmanL20型全自動生化儀;超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)、總抗氧化能力(TAO-C)應用比色法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。胰島素的測定應用化學發光法。
2、胰島素敏感性及胰島B細胞功能相關指標計算公式：
穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=(FPG×FIns)/22.5。
3、外周血EPC計數: 取外周血2mL，每個流式檢測管分別加入150ul全血，加入10ul一抗;在同型對照管中加入10ul 緩衝液。並輕輕混勻。 避光孵育30分鐘後每管分別加入2ml紅細胞裂解液，混合均勻，室溫避光孵育10分鐘，3000r/min，離心5分鐘，棄去上清。用2ml 緩衝液洗滌細胞一次，500ul 緩衝液重懸細胞後上流式儀檢測。
確定CD34+KDR+細胞作為EPCs(試劑盒購自美國Invitrogen公司及R&D公司)。用FACS Calibur分析儀(美國BD公司)分析計數1×105細胞;資料再用軟體(Macintosh CELLQuest; BD Biosciences)進行處理。
4、內皮依賴性血管內皮功能(FMD)的測定：採用二維超聲成像掃描法測定(PHILIPS HDI 5000，美國通用公司)：患者平臥位，將血壓計袖帶縛於右側前臂，袖帶充氣至高於收縮壓50mmHg處，5min後放氣引起反應性充血，30~90s內採集肱動脈影象並結合心電圖測得舒張末期內徑(Dd1)。反應性充血後肱動脈內徑變化(FMD％)=(Dd1-Dd)/Dd×100％。
三、統計學處理
採用SPSS 13.0統計分析軟體包進行分析。所有計量資料用均數±標準差表示，對所測定結果進行正態性及方差齊性檢驗，計量資料多組間比較採用單因素方差分析，組間兩兩比較採用SNK-q檢驗，P<0.05為具有顯著性差異。變數相關關係採用直線相關分析和多元直線迴歸分析。
結 果
1、三組臨床和生化特徵
從表1可以看出，三組在年齡、性別均匹配。BMI三組間無顯著差異。收縮壓、舒張壓在三組間無顯著性差異(P0.05)。FPG和HbA1c在T2DM組較對照組、FDRs組顯著升高(P<0.05)，但在對照組與FDRs組間差異無顯著性(P>0.05)。T2DM的TC水平高於FDRs及NC組(P<0.05)，TG在三組無顯著差異;HOMA-IR在對照組、FDRs、T2DM組逐漸升高，有顯著差異(P<0.05)。
2、三組氧化應激指標及脂肪因子的比較
從表2看出，血清SOD 、TAO-C及GSH-PX水平在T2DM組顯著低於和對照組及FDRs(P<0.01)，但在FDRs和對照組間無統計學差異(P>0.05);血清MDA水平在對照組、FDRs及T2DM組逐漸升高(P<0.01)。
3、三組內皮功能各相關引數的比較
從表3看出，EPCs、FMD在對照組、FDRs、T2DM組逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05)。
討 論
1997年，Asahara等研究發現，在迴圈外周血中存在一種能分化為血管內皮細胞(EC)的前體細胞，命名EPCs，它來源於骨髓、臍血或胎肝，表達某些特定的標誌，如造血祖細胞標誌：CD34 、 CD133和血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)[也被稱作激酶功能區受體(KDR)或胎肝激酶-1(FLK-1)]和 CD31等內皮標誌。
能在體外分離並培養出EPCs，並確定它的特性及功能。但因其費用較高而不能大規模用於臨床研究。因此，用流式細胞術分析表面抗原來鑑定祖細胞被認為是金標準。目前很多研究認為可以將CD34+KDR+細胞作為EPCs,CD34 是造血幹細胞的重要標誌，而KDR 作為血管系統最早出現的細胞標誌，是胚胎期血液血管發生的關鍵受體，也被作為血管 EPCs 的重要分子標誌。
有些學者認為可以應用CD34+KDR+的 EPCs計數來獨立地預測心血管事件的發生在正常情況下，EPCs數量相對較少，但在血管損傷或組織缺血的情況下 , 存在於骨髓中的EPCs可以應答於區域性釋放的生長因子和細胞因子而動員至外周血液迴圈，特異性的歸巢於損傷或缺血部位，進一步增殖、分化為成熟的內皮細胞，參與血管新生和再內皮化。
一旦內皮祖細胞受損，內皮損害和修復之間的平衡被打破，內皮層的完整性遭到破壞，由此發生動脈粥樣病變。因此EPCs對於調節內皮細胞凋亡/再生平衡及保持內皮層的完整性有著重要作用。EPCs尚能分泌生長因子啟用血管區域性的成熟內皮細胞，維持血管內皮的正常功能。
由此，我們可以認為EPCs數量與功能的改變與血管內皮功能密切相關，是血管疾病的重要影響因素，也就是說，骨髓和外周血的EPCs的數量與功能決定著損傷血管的內皮修復程度，所以，EPCs被認為是對各種心血管疾病和損傷血管進行治療的重要生化因子。
糖尿病是心血管疾病的等危症，2型糖尿病與心血管疾病的高發生率和死亡率有關。本研究表明，FDRs及T2DM的EPCs數量較對照組顯著減少，FMD顯著下降，說明在糖耐量正常的糖尿病患者一級親屬已經存在EPCs數量的減少及血管內皮功能受損。
氧化應激(OS)是在缺血、缺氧、高血糖等應激情況下指機體活性氧基團(ROS)以及活性氮基團(RNS)等的過度生成和/或機體抗氧化能力降低導致活性分子清除減少，從而造成氧化系統與抗氧化系統的不平衡，導致組織中的氧自由基水平升高，引起組織損傷或潛在性損傷的病理過程。
抗氧化酶類包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、GSH-PX等，TAO-C 代表了細胞酶促與非酶促抗氧化物的總體水平。氧化應激是引起糖尿病血管併發症的機制之一，目前認為GPx-1及MnSOD活性下降是冠狀動脈疾病患者心血管事件的獨立危險因子。
本研究結果顯示，T2DM組的血清SOD 、TAO-C及GSH-PX水平顯著低於NC及FDRs組,血清MDA水平在FDRs及T2DM顯著升高，說明在糖耐量正常的T2DM一級親屬已經存在氧化和抗氧化系統失衡,這與過去報道一致[8]。
Pearson相關分析表明，在FDRs，IR與MDA呈正相關，與SOD、TAO-C、GSH負相關,說明在糖尿病一級親屬氧化應激與IR密切相關。有研究表明，T2DM患者血糖正常非肥胖一級親屬存在胰島素抵抗及肌細胞內脂類增多，出現骨骼肌線粒體功能障礙而導致的氧化應激[9]，而IR是機體細胞水平對過多ROS的一種生理性防禦機制。
與其他組織細胞相比，β細胞內清除自由基的酶類(抗氧化酶)以及ROS清除蛋白如硫氧還蛋白的含量很低，因而對活ROS極為敏感，最易受氧化應激攻擊，因此，在內源性抗氧化系統代償不足時，機體就會出現氧化還原失衡，啟用應激敏感性訊號通路，引起β細胞功能失調，進一步加重IR，最終導致T2DM及其慢性併發症的發生。
由此我們可以推測，由於遺傳和環境因素的影響，出現氧化應激，二者相互促進，進一步導致胰島素抵抗及β細胞功能衰竭，從而誘發了糖尿病及其併發症的發生、發展。
把EPCs作為因變數進行多元線性迴歸分析表明，TOA、MDA、GSH-PX、FBG、HbA1c進入方程(R=0.979，P<0.05)，差異有統計學意義，說明血糖水平及氧化應激是EPCs的影響因素。
高血糖及其代謝產物可以通過多種途徑影響EPCs及血管內皮功能，從而導致血管併發症的發生：
(1)高糖和TNF-α通過啟用EPCs內的p38-MAPK從而下調EPCs的數量;
(2)高糖介導的FoxO轉錄因子磷酸化/乙醯化失衡,可能使FoxO蛋白表達增加,上調前凋亡基因表達,介導EPCs凋亡，Sir2 (silent information regulator-2,沉默資訊調節因子-2 ) 對FoxO具有反向調節作用，高糖通過Sir2而影響FoxO，進一步導致EPC功能受損。
(3)高糖導致EPCs釋放的NO的生物利用度降低或eNOS的輔基四氫生物蝶呤(BH4)下降，從而出現eNOS的解偶聯，產生超氧負離子(O-)，導致活性氧簇(ROS)的積聚，進一步使EPCs的數量及遷移能力降低。
(4)高血糖通過使EPCs功能受損而釋放微粒(MPs)，而MPs通過啟動外源性凝血途徑以及與血小板形成聚合物可促進血栓和纖維蛋白的形成;啟用中性粒細胞,促進單核細胞與內皮細胞結合並對中性粒細胞產生趨化作用,參與炎症反應的發生，從而影響血管內皮功能。
氧化應激通過促進EPCs的調亡而影響其功能及數量，其分子機制為： forkhead轉錄因子調控的促凋亡蛋白Bim的表達是EPCs凋亡的一個關鍵訊號通路，氧化應激可通過誘導B im 的表達水平上調, 引起EPCs凋亡 ，HMG2CoA還原酶抑制劑statins可通過PI3 /Akt訊號通路磷酸化forkhead轉錄因子,使其失活, 從而下調Bim表達水平, 保護EPCs不發生氧化應激引起的細胞凋亡;
氧化應激還可通過ROS-p53-Bax途徑引起EPCs的凋亡[14]，誘導EPCs端粒酶的失活而促進其衰老及調亡。曾有報道顯示，Eric的研究也表明，應用錳超氧化物岐化酶(MnSOD)轉染的EPCs可促進糖尿病小鼠的傷肢癒合。
總之，本研究表明，在糖耐量正常的2型糖尿病一級親屬已經出現了胰島素抵抗、氧化應激、內皮祖細胞數量的減少及血管內皮功能受損，而氧化應激可能是糖尿病及其血管併發症的始發因素。
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