肺癌是世界上發病率和病死率最高的惡性腫瘤，近20年來，我國肺癌導致的死亡超過癌症總死因的20%。由於早期肺癌的臨床症狀不明顯，80%的肺癌患者就診時已屬中晚期，其中50%以上患者不能手術且5年生存率僅有10%。改善預後的關鍵就在於早期發現、早期診斷。撥出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）檢測具有無創傷、簡單易操作、可反覆進行等優點，其中某些成分的顯著變化可以反映肺內及氣道內的病理生理狀態，有望成為高危人群篩查早期肺癌及輔助肺癌早期診斷、病情監測及療效判斷的新型手段，但是目前仍處於探索階段，尚有很多未解決的問題。海南醫學院附屬醫院放療科盧彥達
1 EBC檢測的概況
平靜呼吸時，撥出氣體通過特殊的冷凝裝置形成液態，即為EBC。用於EBC收集的裝置主要有3種：一為美國生產的RTUBE便攜裝置，中間置一聚丙烯管，冷凝後的液體可附於內管壁；二為德國埃裡希積有限公司生產的Ecoscreen電動製冷裝置；另外國內也有自制冷凝裝置的報道。皆包括一含單向閥門的製冷管，可將吸入氣和撥出氣分離，防止反覆吸入撥出氣，且採集時要求受試者漱口，帶鼻夾排除鼻腔，鼻安所產生物質的干擾，有唾液時囑其嚥下，咳嗽時需暫停收集。受試者經口呼吸10～15 min，冷凝器中可收集1～3 ml冷凝物，收集標本需通過檢測其中澱粉酶的含量來確定是否存在唾液的汙染。與傳統檢測手段相比，EBC檢測具有真正完全無創、瞬時、可實現動態監測、適用人群更廣等優勢。
EBC為一種高度稀釋的體液，通過特殊的、高度敏感的檢測方法可測到一些揮發性物質（如一氧化氮、一氧化碳等）、非揮發性物質（如亞硝酸鹽、氨及有血管活性的胺類物質）、蛋白質、多肽、核酸及一些脂類代謝物等。研究報道在EBC中可以檢測到數千種物質，且不斷有新的物質被檢測到，它們主要來自下呼吸道內襯液，推測認為是呼吸氣流形成“氣旋”將氣道內襯液“刮落”或是吸氣時氣道擴張形成的張力將表層液相“撕裂”所致。這些物質可隨疾病及治療干預等而改變。通過對EBC中的這些生化分子（一般相對分子質量小於65 000）或pH值等引數的變化進行檢測，可反映氧化損傷、炎症等氣道狀態。
對於EBC檢測的研究主要集中於採用病例一對照研究或橫、縱向研究方法等進行EBC中可檢測因子及pH等的研究，為應用於臨床診斷、鑑別診斷提供實驗依據；尋找影響EBC檢測的可能因素，如收集裝置、收集方法、檢測方法等來進行EBC檢測標準化方面的研究。目前國內外研究較多的是EBC中的炎性標誌物，如過氧化氫、一氧化氮及其相關產物（硝酸鹽/亞硝酸鹽）、前列腺素、白三烯等，這在氣道炎症的I監測和治療方面有著重要的應用價值。許多學者通過研究發現在EBC中尋找肺癌特異性的腫瘤標誌物及聯合多種標誌物來進行肺癌診斷對肺癌的篩查、早期診斷、病情監測及預後判斷也有著重要的應用意義。
2 肺癌患者EBC中可檢測的主要因子及其意義
肺癌的形成是一個多階段、多步驟、多基因參與的過程，在不同階段相繼或同時有不同基因或細胞因子等的改變。目前關於EBC中肺癌標記物檢測的研究越來越多，主要分為特異性標記物和非特異性標記物，前者包括氧化應激或炎性標記物等，後者主要包括腫瘤血管生成及基因突變等相關的標記物等。
2.1 氧化應激標誌物 研究表明氧化應激引起體內氧化劑與抗氧化劑水平失衡，進而導致脂質過氧化是肺癌發生、發展過程中的一個重要步驟，8-異前列腺素、過氧化氫可作為體內氧化應激的量化指標。1994年Khyshiktyev等研究提出肺癌患者EBC中脂質過氧化產物水平低於正常人群。後有研究表明，以健康吸菸者為對照，肺癌患者血清中8-異前列腺素的水平是增加的，且在進展期肺癌中升高更明顯，而在肺癌患者EBC中其水平無升高，且與臨床分期、年齡等無顯著關聯。另有學者對21例非小細胞肺癌患者、21名非吸菸健康者、13名曾吸菸者、16名現吸菸者EBC進行檢測，發現肺癌患者EBC中8一異前列腺素、過氧化氫水平明顯高於吸菸人群。脂質過氧化產物在肺癌患者EBC中的水平變化尚存在著爭議，且氧化應激與多種疾病均密切相關，因此其量化指標在肺癌早期診斷及病情監測應用中尚需進一步探索。
2.2生長因子/內皮素 內皮素-1是由21個氨基酸組成的多肽，具有調節有絲分裂和血管舒縮等能力。肺動脈內皮細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞皆可分泌大量內皮素，刺激血管平滑肌細胞、成纖維細胞等的增殖，參與肺癌的發生、發展。Carpagnano等研究發現在大部分非小細胞肺癌細胞株中可檢測到水平升高的內皮素-1，並檢測了30例肺癌患者EBC中內皮素-1的水平，與健康對照組相比，其水平是顯著增高的，且與肺癌分期呈正相關，且Ⅰ期肺癌患者在手術後，EBC中的內皮素-1水平也相應下降，從而初步推斷EBC中內皮素-1可以作為一種肺癌早期診斷的標誌物，也可應用於對肺癌的病情監測。
另外，Carpagnano等還研究發現非小細胞肺癌患者EBC中白介素2、白介素6的水平是顯著增高的，但是這些炎性細胞因子的特異性不高，可伴隨機體創傷、炎症和腫瘤等多種病變。有研究提出內皮素-1水平的增高也可出現在肺動脈高壓、肺纖維化患者及炎性肺疾病患者的EBC中；白介素6的水平在慢性阻塞性肺疾病、哮喘患者EBC中顯著增高，因此這些生長因子類的標誌物在單獨應用於肺癌時具有侷限性。當出現結果不一致時，應該與其他肺癌標誌物聯合應用進行分析和研究，進而為其在肺癌早期診斷等方面的應用提供更多的實驗依據。
2.3血管生成相關因子 研究證實血管內皮生長因子（VEGF）、鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF）等多種活性物質參與調節腫瘤血管生成，可作為腫瘤特異的分子標誌物。2008年Gessner等研究提出與健康人群和慢性阻塞性肺疾病患者EBC中血管相關因子水平相比，非小細胞肺癌患者EBC中VEGF、bFGF、血管生成素的水平顯著增高，但與肺癌分期、解剖學和組織學型別無顯著關聯。經過2次化療後（腫塊直徑至少減少25%）的患者，EBC中血管相關因子的水平顯著下降，初步認為通過檢測EBC中血管相關因子的水平對指導肺癌治療及監測治療反應具有重要的意義，但仍需要進行大規模的基礎和臨床研究來提供實驗依據。
2.4核酸在肺癌發生與發展過程中，大量癌變的支氣管或氣道上皮細胞的DNA可直接脫落到呼吸道內襯液中，推測在EBC中進行基因表達分析用於肺癌早期診斷是具有可行性的。目前熱點主要集中於在EBC中探尋特異性的微衛星改變位點、檢測p53基因突變及基因啟動子甲基化狀態等。
2.4.1 微衛星改變 Hung等發現在肺癌患者的3p14、3p21和3p25等部位出現頻繁的等位基因特異性丟失。Miozzo等應用PCR結合微衛星分析法發現在3p21、3p24和3p25等部位出現微衛星不穩定性。因此測定3p位點微衛星改變對肺癌的診斷有一定的價值。2005年Carpagnano等收集30例非小細胞肺癌患者和20名健康受試者的EBC和全血，提取DNA並檢測3p區域的5個微衛星位點 （D3S238、 D3S1266、 D3S1300、 D3S1304、D3S1289），發現在非小細胞肺癌組中，53%的EBC-DNA和10%的全血-DNA中可檢測到微衛星改變，而在健康對照組，13%的EBC- DNA和2%的全血一DNA中可檢測到，說明在探尋肺癌特異的微衛星改變中，EBC-DNA具有更高的敏感性，另外結果還顯示在肺癌患者EBC-DNA中微衛星改變數目與受試者吸菸量直接顯著相關，提示該手段可在對高危人群進行肺癌篩查和診斷等方面具有一定的應用價值。
隨後Carpagnano等又證實了對非小細胞肺癌患者EBC-DNA 3p區域中微衛星位點分析的結果與相應肺癌組織中的分析結果具有一致性，通過檢測EBC-DNA可以反映體細胞的突變。另外研究發現EBC中3p區域微衛星改變的數目與非小細胞肺癌患者的預後顯著相關，其中D3S1289位點雜合子丟失與肺腺癌患者預後呈負相關，而D3S2338位點的雜合子丟失則影響肺鱗癌患者的預後。有研究表明ERCC是核苷切除修復通路的限速酶，也參與到肺癌的發生、發展中。基於此，Carpagnano等對34例非小細胞肺癌患者、33名健康志願者（19名非吸菸者，14名吸菸者）進行研究，檢測來自EBC和全血的DNA的19q區域2個微衛星位點：D19S908（ERCC-1基因座點）和D19S393（ERCC-2基因座點），並對其中25例肺癌患者進行隨訪研究，結果顯示在健康非吸菸者EBC和全血DNA中未檢測到微衛星改變；健康吸菸組和非小細胞肺癌組各有16%和25%的EBC-DNA可檢測到微衛星改變；EBC-DNA的微衛星改變率與受試者吸菸量及患者預後有關（D19S393雜合子缺失與預後密切相關），與肺癌組織型別無關。
雖然被檢樣本數最較少且研究尚處於早期階段，還需進一步深入研究，但研究人員認為，在肺癌患者EBC中可檢測到微衛星改變，其陽性率顯著高於健康對照，且陽性檢出率高於全血，對肺癌的早期篩查、診斷及病情監測隨訪具有可行性。
2.4.2 突變型p53基因 大量究表明，p53基因中熱點突變密碼子的出現與菸草中的多環芳香烴類致癌物（如苯並芘等）有關，檢測p53基因突變可以反映癌前病變的損害程度，提示在EBC中檢測p53基因突變點對於高危人群篩查早期肺癌具有一定的特異性。2004年，Gessner等招募18例非小細胞肺癌患者（皆為吸菸者）和18名健康志願者（4名已戒菸5年以上，餘為非吸菸者），收集EBC，提取DNA，採用巢式PCR實驗擴增p53基因的第5外顯子至第8外顯子並測序進行觀察，發現11例非小細胞肺癌患者中有4例存在p53基因突變（36.4%），健康志願者中未檢測到p53基因突變；且發現在EBC中檢測到的p53基因突變情況與在相應組織中檢測到的突變情況不一致，研究者認為這可以用區域性癌變來解釋，EBC可以反映氣道及肺實質的整體情況，而活組織檢查因取材的侷限性，僅能反映區域性癌變情況。同時發現存在支氣管不典型增生的患者EBC中可檢出突變的p53基因，p53蛋白陽性的不典型增生細胞同時有p53基因突變，傾向於維持其不可逆性的不典型增生，部分發展為鱗癌。因此推測在EBC中檢測p53基因監測肺癌是可能的，但有待進一步研究，應用於臨床尚有差距。
2.4.3 DNA甲基化有實驗證明啟動子超甲基化可直接或間接阻遏轉錄的進行；也可通過5-甲基胞嘧啶脫氨基誘發胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶，導致基因置換突變，誘發基因表達異常；還可引起基因組中相應區域染色質結構變化，使染色質高度螺旋化，凝縮成團，導致基因表達不穩定等進而誘發遺傳病或腫瘤。
2009年Han等對17例肺癌患者和37名健康志願者進行研究，採用亞硫酸氫鹽處理後測序法檢測受試物件EBC中Ras相關區域家族1A基因（RASSF1A）與死亡相關蛋白激酶基因（DAPK）啟動子甲基化的情況。結果顯示2種基因啟動子甲基化程度及空間分佈狀況有著很大的個體差異；RASSF1A甲基化的程度與受試物件吸菸程度相關；DAPK基因的-63區域的CpG位點在肺癌組和非肺癌組之間存在著差異；啟動子甲基化程度與肺癌分期及組織學無相關。這些提示在EBC中檢測基因甲基化是可行的，有可能提供關於吸菸暴露及疾病狀態等的資訊。
3 存在的問題與展望
EBC檢測是一種全新的方法，可提供下呼吸道和肺實質的早期病變訊號，其收集裝置具有便攜的特點，收集不受年齡、性別、病情程度的影響，收集過程不會改變呼吸道環境等使得EBC檢測手段具有完全無創、簡便快捷、可實現實時動態監測等優勢，幾乎可以應用於所有患者（包括小兒患者、機械通氣患者及昏迷患者等）。然而該手段還處於探索的初級階段，不同學者的研究結論還存在差異，甚至互相矛盾，難以進入臨床應用。EBC中所檢測到的物質來源的具體解剖定位尚不明瞭，缺乏特異性；EBC為一高度稀釋的體液，其中某些物質濃度極低，不易檢測；EBC的稀釋度在個體間存在著很大的差異，目前尚缺乏確定EBC稀釋度統一的方法，從而可能會影響對檢測結果的評估；尚無大規模人群的研究報道，缺乏各種物質在EBC中的正常參考值；研究者所用的裝置或收集及檢測方法不同，可能得出不同的結果，也使得結果之間缺乏可比性；該方法的重複性和穩定性也需要進一步研究證實。另外，應用該手段進行肺癌診斷的特異性與敏感度仍有待進一步的實驗研究，然而隨著檢測技術的進一步改進及對肺癌發生、發展過程和分子機制研究的不斷深入，檢測EBC中肺癌相關的生化標記物定能在臨床研究肺癌發病機制、肺癌篩查、病情監測、療效評估和跟蹤隨訪等方面顯示出舉足輕重的地位。
2013-02-24 16:09 來源：國際呼吸雜誌 作者：董 良良 等
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