人體持續更新的組織如骨髓、面板、腸粘膜上皮等存在幹細胞池，通過幹細胞不間斷的增殖、分化來產生成熟細胞。在肝臟，由於成熟的肝細胞仍然具備分裂、增殖的能力，肝組織內是否存在幹細胞是一個長期以來頗有爭議的問題。近年來隨著發育生物學尤其是幹細胞生物學的飛速發展，肝臟幹細胞的存在及其在肝臟疾病發生中的意義越來越受到了廣泛的關注。肝臟的多種病理生理過程可能與幹細胞的異常增殖、分化密切相關；而肝臟幹細胞的深入研究對於各種急、慢性肝臟疾病以及肝細胞癌的治療也顯示出了誘人的前景。肝臟幹細胞的認識以及圍繞這一特殊幹細胞的相關研究已經成為現代幹細胞生物學和臨床醫學的研究熱點之一。 濟南軍區總醫院消化內科張智高
1 肝臟幹細胞的概念
1.1 胚胎肝臟幹細胞 人體胚胎髮育早期，前腸末端的肝憩室演化為肝部和尾部兩個部分，其中肝部生長極為迅速，至胚5周時已經充填於腹腔大部［1］。這些向肝臟演化的胚胎樣肝細胞我們稱之為成肝細胞（Hepatoblasts），它不但具有旺盛的增殖能力，而且具有向肝細胞和膽管細胞分化的潛能［2］，所以成肝細胞實際上就是胚胎肝臟幹細胞。只有前腸末端在胚胎髮育中可以被誘導成成肝細胞。4個轉錄因子家族在肝細胞特定分化基因的表達中發揮了重要作用：①具有相同結構域的各種肝細胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1）；②系列肝細胞核因子3蛋白（HNF3）；③核受體超家族；④亮氨酸拉鍊家族（C/EBP）。靶細胞在上述轉錄因子的調控下，通過特定基因的表達而產生表型的改變。
胚胎肝臟幹細胞的細胞標誌包括分化標誌如白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）和系列細胞角蛋白（CK7，8，9，14，18，19，20),相關的幹細胞因子和受體如Thy1、Flt3、SCF/ckit、OV6，髓源性幹細胞標誌如CD34等（表1）。Taniguchi等［3］基於上述細胞標誌用流式細胞分選法（FACS）成功地對胚胎肝臟幹細胞進行了分離培養，分離的胚胎肝臟幹細胞向同系動物肝臟移植可以分化成肝細胞和膽管上皮細胞，表明胚胎肝臟幹細胞的確具有多向分化潛能。
1.2 成體肝臟幹細胞 正常肝臟是否存在幹細胞尚有爭議。有學者基於成熟肝細胞在肝損傷後可以不間斷地恢復增殖能力的特點，提出肝臟本身就是一個“幹細胞池”的觀點。然而根據幹細胞的定義，幹細胞除了具備分裂增殖能力以外，還應具備一定的分化潛能。成熟肝細胞分裂產生的後代細胞仍然是成熟肝細胞，因此從嚴格意義上講，成熟肝細胞不應被看作是幹細胞。
現在認為，在膽管樹的末梢區域，即相當於組織學上的郝令氏管（canals of Hering）區，存在具有雙向分化潛能的上皮細胞，可能是來源於膽小管周圍、體積更小的“未定性（nondescript）”間質細胞。在肝臟嚴重受損及/或成熟肝細胞的增殖受阻的情況下，它們可以異常啟用、增殖，大量出現在肝小葉外周區域，組織學上表現為肝小葉周圍體積較小、增殖活躍的細胞群體。這些細胞核質比大，胞核圓形或卵圓形，被稱之為肝卵圓形細胞（hepatic oval cells,HOC）。大量增殖的卵圓形細胞沿肝實質向肝小葉中央區遷移，分化成成熟的肝細胞，修復和重建肝臟。與此同時，卵圓細胞也可以向膽管上皮細胞分化，參與肝內膽管的形成。目前普遍認為，肝卵圓形細胞就是成體肝組織內的幹細胞。卵圓細胞被認為是肝臟幹細胞的另外一個重要證據是，它與胚胎肝臟幹細胞即成肝細胞具有相似的細胞標誌，與造血幹細胞具有一些共同的表面抗原（表1）。
誘導成體肝臟卵圓細胞的大量增殖有兩個先決條件：其一，存在刺激肝組織再生的因素，在動物模型中常用的是大部分肝切除或毒物（如四氯化碳）引發的肝細胞壞死；其二，正常肝細胞的增殖受到抑制，動物實驗中所用的抑制成熟肝細胞分裂的藥物有2乙醯氨基芴（2acetylaminofluorene,2AAF）、煙麴黴毒素B1（fumonisin B1,FB1）、倒千里光鹼性（retrorsine）或膽鹼缺乏乙硫氨酸（cholinedeficient ethionine containing,CDE）飲食等。
幹細胞不執行分化細胞的功能，其功能是通過增殖產生成熟分化的細胞。幹細胞分裂產生的子代細胞只能在兩種途徑中選擇其一：或者保持親代特性，仍保持幹細胞的身份；或者沿著特定的途徑向終末分化。表1 成肝細胞、卵圓細胞、肝細胞、膽管上皮細胞及肝癌細胞的細胞標誌 注：+：陽性；-：陰性；？：尚未確定1.3 肝臟幹細胞的多源性和可塑性 近年來，幹細胞研究領域尤為激動人心的是成年個體多潛能祖細胞（multipotent adult progenitor cells,MAPCs）的發現。肝臟幹細胞可以來源於肝臟本身，但人體及動物實驗均證實非肝源性幹細胞可以向肝臟幹細胞乃至成熟肝細胞分化。離體的骨髓多潛能祖 細胞在體外培養過程中加入特定的生長因子，即可被誘導產生有特定表型的肝幹細胞和肝細胞［4］。在接受骨髓移植的病人和動物模型肝組織中可以發現帶有供體基因標記的肝細胞已為若干研究所證實。不同型別組織間幹細胞的橫向分化也有報道，如Dabeva(1997)從大鼠胰腺組織分離出的上皮細胞移植至近交系大鼠肝臟後，發現該種細胞也可以分化成肝細胞，它們可以整合到肝小葉結構中並表達肝細胞特異性蛋白。骨髓源性祖細胞是以什麼樣的身份經過血液迴圈到達肝臟尚不明確。研究資料表明，骨髓內的細胞成分主要有造血幹細胞（hematopoietic stem cells,HSCs）、間充質幹細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）和內皮祖細胞（endothelial cell progenitors）。目前體內外實驗證實造血幹細胞（HSCs）［5］和骨髓間充質幹細胞（MSCs）［6］均可以分化成肝細胞。肝臟卵圓細胞攜帶骨髓幹細胞標記如CD34、Thy1、Fly3、SCF/ckit，尚不能說明它與造血幹細胞有某種必然的聯絡。骨髓內的多潛能祖細胞是在不同的微環境下獲得了橫向分化的（transdifferentiation）能力，還是它們本身就是更為原始的多分化潛能祖細胞尚不明確。
肝臟卵圓細胞具有可塑性。卵圓細胞可以分化成胃腸道上皮細胞以及具有內分泌功能的胰腺細胞［7］；在腦組織，卵圓形細胞可以分化成神經細胞和神經膠質細胞［8］；在心臟，肝臟幹細胞可以分化成心肌細胞［9］。Asakura［10］的研究發現，包括肝臟在內的若干個器官的幹細胞可以分化成骨髓造血幹細胞，Murase［11］對致死量照射的大鼠單純實施肝移植後可以重建骨髓造血功能，與骨髓移植具有完全相同的救治效果。有報道在接受肝移植治療的病人，在隨後移植肝中所發現的B細胞淋巴瘤為供體起源（瘤細胞具有供體的基因標誌）［12］；香港大學報道一類似病人，其移植肝中所發現的間葉樣肉瘤也是供體起源［13］。Smith［14］等報道在臨床肝移植伴發的移植物抗宿主反應（graftversushost disease,GVHD)中，可以發現宿主體內嵌合大量有免疫活性的供體起源的淋巴細胞。這些異常增殖的淋巴細胞和間葉細胞起源於供體肝臟的細胞來源可能有二：其一，供肝離體後儘管實施了徹底的肝臟灌注，但仍然殘留了部分造血幹細胞，它們是起源於供肝中殘存的血液/造血幹細胞；其二，如果肝臟幹細胞有足夠高的可塑性，它們也可能是起源於供肝中的多潛能祖細胞。
2 肝臟幹細胞與肝臟疾病
2.1 肝臟幹細胞與急性肝損傷 肝臟損傷後再生反應發生的非常迅速、全面（殘留的肝細胞均進入增殖狀態），受控於精確的調控機制（各種生長因子、細胞因子和激素的協同作用），再生的同時又可行使其正常的生理功能（如解毒、膽汁分泌、糖原合成等）。動物實驗和臨床研究均已證實，急性肝損傷所誘發的肝組織再生主要由殘存的正常肝細胞重新進入細胞週期而完成。理論上，對於2/3肝切除的大鼠，殘餘的肝細胞平均經過3/2個細胞週期即可完成肝組織的再生，整個再生過程持續1~2周即可完成。臨床上肝部分切除和急性肝炎所導致的肝細胞壞死可能歷經與動物模型相似的再生過程。
如果成熟肝細胞的分裂增殖受到抑制，抑或肝細胞的壞死範圍過大，肝臟再生就不得不通過動員幹細胞的增殖來完成。在實驗性肝再生模型上，可以清楚地觀察到卵圓形細胞首先在肝小葉周圍大量增殖，並隨時間的推移逐漸向小葉內遷移。臨床上，對於急性大塊肝壞死的組織學觀察也發現，卵圓細胞首先出現在小葉周邊的界板區域，大約在肝損傷的第4天，卵圓細胞轉化為肝細胞。
2.2 肝臟幹細胞與慢性病毒性肝炎 在臨床實踐中，急性肝組織的損傷與再生實際上並不是很多見，我們所經常面臨的問題是慢性肝炎所造成的反覆而持續的肝細胞損傷以及在這種狀態下肝細胞的代償性增殖。
在肝細胞內，HBV病毒完成其自身的複製，甚或與肝細胞的基因組發生位點非特異性的整合。同時，病毒基因利用肝細胞的蛋白合成裝置裝配病毒特異性蛋白。病毒蛋白作為內源性抗原在肝細胞內加工處理後與MHCI類分子結合並被遞呈至肝細胞表面，被CTL特異性識別或通過Fas系統殺傷肝細胞。假如，機體通過有效的免疫機制將病毒清除，代償性再生完成後肝細胞不再被破壞，機體得以恢復。然而，乙型（或丙型）肝炎的特點是病毒難以被清除，肝細胞的損傷與再生反覆而持續存在，尤其是感染後期，成熟的肝細胞廣泛地被病毒感染，而且被病毒感染的肝細胞常常失去增殖能力（組織化學顯示有病毒抗原陽性的細胞PCNA極少陽性染色），幹細胞的增殖分化便成為代償性增殖主要細胞群體。實驗研究也證實，肝炎肝硬化病人，組織病理學發現在增生灶的周圍有增殖狀態的幹細胞［15］。
肝臟幹細胞主要存在於終末膽管，慢性肝炎（尤其是活動性肝炎）的組織學特點之一是匯管區及其周圍的纖維結締組織間隔出現大量的膽小管增生。儘管我們對慢性肝炎肝纖維化的機理尚未弄清，但纖維化的產生與肝臟幹細胞的增殖似乎存在著某種必然的聯絡，病人血清高AFP水平也可能與幹細胞的異常增殖有關。
2.3 肝臟幹細胞與原發性肝癌 腫瘤學目前對肝細胞癌來源於成熟肝細胞的分化（dedifferentiation)，還是來源於幹細胞的分化受阻（maturation arrest of stem cell differentiation）或失分化（dysdifferentiation)意見不一。
去分化觀點認為，致癌物作用的靶點是成熟的肝細胞，引起靶細胞基因突變及/或遺傳物質的不穩定。支援該學說的實驗證據有：用逆轉錄病毒介導的基因轉染標記成熟的肝細胞，在2乙醯氨基芴（2AAF）誘導的肝癌模型中，癌前病灶可以起源於成熟的肝細胞。對人類肝癌而言，成熟肝細胞的去分化假說似乎是一種被普遍接受的觀點。目前人類肝癌的分子生物學研究主要圍繞腫瘤相關基因的篩選以及病毒基因組的整合所可能引起的肝細胞基因組的突變或不穩定。
分化受阻假說認為，致癌物作用的靶點是幹細胞分化成熟的微環境，各種導致該微環境結構異常及/或化學信使傳遞異常的因素是致癌作用的首要原因，腫瘤的本質是起源於組織內原已存在的幹細胞的分化受阻［16］。我們的研究也發現，慢性肝炎組織、肝硬化組織及癌旁肝組織可以高水平表達乙肝病毒蛋白產物，但在癌組織內，病毒抗原的表達卻神祕消失，被病毒感染的肝細胞常常失去增殖活性（PCNA陰性），有增殖活性的細胞常常是肝小葉周邊體積較小的“卵圓形細胞”，即肝組織內的幹細胞。
支援分化受阻學說的其它證據還有：肝惡性腫瘤組織內有卵圓細胞存在［17］；肝癌細胞和卵圓細胞表達相似的細胞標誌如AFP，GGP，細胞角蛋白系列CK（7，8，18，19，20），轉錄因子OC2、OC3，卵圓細胞標誌OV1、OV6，幹細胞標誌SCF/ckit和CD34；不少研究發現，肝癌細胞還表達B細胞分化抗原如CD10和CD40，但該抗原在卵圓細胞和成肝細胞中是否表達尚未見報道；幹細胞和癌細胞都具備端粒酶活性；肝癌細胞內病毒的低複製或不復制以及病毒抗原的低表達或不表達；肝癌的多中心起源問題；體外培養的肝癌細胞系具有異質性和雙向分化特性。儘管幹細胞分化受阻的假說早為一些作者提出，但至今尚無直觀的證據證實肝癌細胞就是來源於體內原已存在的幹細胞。
3 肝臟幹細胞的應用前景
目前對肝臟幹細胞的研究還剛剛起步，對肝臟幹細胞的分離、培養和鑑定技術還不成熟，對其與慢性肝臟病理過程以及肝癌之間的關係尚有待於進一步闡明，對成體肝臟幹細胞的多源性和多向分化性的調控機制還沒有弄清，但肝臟幹細胞的臨床應用仍顯示了非常誘人的前景。
3.1 肝臟幹細胞與肝功能的重建 各種原因所導致的急性和亞急性肝細胞壞死，如果肝臟的基本構架尚存，利用肝臟幹細胞無限增殖的特點及其可以向肝細胞和膽管細胞分化的潛力，可望通過人肝臟幹細胞移植來救治患者。
人類遺傳缺陷性肝臟疾病如肝豆狀核變性，有可能通過移植肝臟幹細胞來取得與肝移植相似或更好的治療效果。早在10年前Rhim等報道分離基因型正常的成年小鼠肝細胞向白蛋白尿激酶（AlbuPA)轉基因小鼠移植，可以糾正轉基因小鼠肝功能的缺陷，表現為無AlbuPA毒性的肝細胞增殖，最後取代基因缺陷的肝細胞。次年，該作者又報道將大鼠肝細胞移植至免疫耐受的AlbuPA轉基因小鼠獲得成功，大鼠肝細胞100％取代基因缺陷的小鼠肝細胞。而Overturf採用的動物模型是延胡索乙醯水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,FAH）基因缺陷小鼠，這種小鼠發生遺傳性酪氨酸血癥Ⅰ型（hereditary tyrosinaemia typeⅠ，HT1）退行性肝病，他通過正常肝細胞移植來觀察對其基因缺陷的糾正效果，結果發現僅需1000個肝細胞即可大部分取代原缺陷肝細胞，認為肝細胞具有類似造血幹細胞的增殖潛力。然而一般認為，分化的肝細胞植入體內後增殖潛力有限，分化方向單一，而且成熟肝細胞體積較幹細胞大的多，門靜脈注射後不易分散到肝實質，因此還是應主張幹細胞移植。在臨床上，Kumar等［18］報道1例原發性澱粉樣變性所致的肝衰竭經肝移植後仍然復發，肝移植10和14個月後實施幹細胞移植而獲得治癒。
3.2 肝臟幹細胞與肝細胞癌的治療 如前所述，肝癌的發生可能是肝臟幹細胞的分化受阻，據此可以通過改善肝臟的微環境來誘導癌細胞向正常細胞分化，或者誘導癌細胞凋亡來達到治療目的。早在10年前，Coleman［19］報道由大鼠肝臟幹細胞系WBF344惡性轉化的異倍體肝癌細胞株GN6TF和GP7TB向同系大鼠肝內移植，結果GN6TF未發生腫瘤，癌細胞整合到了肝實質內形成了正常的肝板；而GP7TB在肝內仍有成瘤性，但腫瘤在組織形態上分化良好。其結論是肝組織的微環境可以影響癌細胞的分化，消除或減低腫瘤細胞的惡性潛能。目前已有若干體外誘導肝癌細胞系向成熟肝細胞表型分化的實驗報道，但誘導分化的分子機制及臨床應用前景尚有待於進一步的研究。
3.3 肝臟幹細胞與基因治療 基因治療是遺傳缺陷性疾病乃至惡性腫瘤最有前途的治療方法，不存在免疫排斥反應，患者無需長期服用免疫抑制藥物。鑑於成熟肝細胞體外培養的限制性，將外源基因匯入肝細胞較為因難，而利用幹細胞則較為容易。只要宿主肝細胞生長的微環境良好，經過基因改造的肝臟幹細胞或骨髓幹細胞可望糾正肝臟代謝缺陷性疾病，這種基因修飾的幹細胞自體移植的確顯示了良好的應用前景。
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