一、術前準備
同纖維支氣管鏡(纖支鏡) 術前準備,常規在纖支鏡氣道檢查後於活檢刷檢前做BAL。區域性麻醉劑為2 ％利多卡因。
二、BAL 操作技術
1、灌洗部位選擇:對瀰漫性間質性肺疾病選擇右肺中葉(B1 或B5 ) 或左肺舌段,侷限性肺病變則在相應支氣管肺段進行BAL。
2、BAL 操作步驟: 首先在要灌洗的肺段經活檢孔通過一細矽膠管注2 ％利多卡因1～2ml ,做灌洗肺段區域性麻醉; 然後將纖支鏡頂端緊密楔人段或亞段支氣管開口處,再經活檢孔通過矽膠管快速注入37 ℃滅菌生理鹽水,每次25～50ml ,總量100～250ml ,一般不超過300ml ; 立即用50 ～100mmHg(1mmHg = 0. 133kPa) 負壓吸引回收灌洗液, 通常回收率為40 ％～60 ％; 將回收液體立即用雙層無菌紗布過濾除去粘液,並記錄總量; 裝入矽塑瓶或塗矽滅菌玻璃容器中(減少細胞粘附) ,置於含有冰塊的保溫瓶中,立即送往實驗室檢查。
支氣管肺泡灌洗液(BALF) 實驗室檢查
一、BALF 細胞總數和分類計數檢測
1、將上述回收灌洗液裝入塑料離心管內, 在4 ℃下以1 200r/ min 離心10min ,上清(原液或10 倍濃縮) - 70 ℃儲存,用做可溶性成分的檢測。
2、經離心沉澱的細胞成分用Hank’s液(不含Ca2 + 、Mg2 + ) 在同樣條件離心沖洗2 次, 每次5min。棄去上清後加Hank’s 液3～5 ml 製成細胞懸液。也可以應用灌洗原液以減少細胞丟失。
3、在改良的Neubauer 計數臺上計數BALF 中細胞總數,一般以1 ×109/ L表示。如果細胞數過高時,再用Hank’s液稀釋,調整細胞數為5 ×109/ L ,並同時將試管浸入碎冰塊中備用。
4. 細胞分類計數:採用細胞離心塗片裝置,加入備用細胞懸液(細胞濃度為5 ×109/ L) 100μl ,在4 ℃下以1 200 r/min 離心10 min ,通過離心作用將一定數量的BALF 細胞直接平鋪於載玻片。取下載玻片立即用冷風吹乾,置於無水乙醇中固定30 min 後進行染色,一般別Wright 或HE 染色。
5、在40 倍光學顯微鏡下計數200個細胞,進行細胞分類計數。
二、BALF 中T 淋巴細胞亞群的檢測
1、採用間接免疫熒光法,將上述獲得的BALF 細胞成分,用10 ％小牛血清RPMI 1640 培養液3～5ml 製成細胞懸液。
2、將細胞懸液倒人平皿中,置於37 ℃5 ％CO2 培養箱中孵育2h ,進行貼壁處理,去除肺泡巨噬細胞。
3、取出細胞懸液,再用Hank’s 液沖洗離心1 次,棄上清留20～100μl 。經貼壁處理後的細胞懸液中,肺泡巨噬細胞顯著減少,淋巴細胞相對增多。
4、將經貼壁處理的細胞懸液分裝3個小錐形離心管內,每管20～30μl ,用微量加樣器向標本中加單克隆抗體CD3 ,CD4 和CD8 各20～40μl ,混勻置於4 ℃冰箱中作用1～2h。
5、取出標本,先用Hank’s 液沖洗離心2 次,以12 000 r/ min 離心20s ,然後加羊抗鼠熒光抗體各20～40μl ,置於4 ℃冰箱作用30min。
6、取出標本用Hank’s 液以同樣速度和時間離心沖洗2 次,棄上清留20μl充分混勻細胞,取1 滴於載玻片上加蓋玻片。熒光顯微鏡下數200 個淋巴細胞並計算出標有熒光細胞的陽性率。
幾點說明:
1、用於做支氣管肺泡灌洗的纖支鏡頂端直徑應在5. 5～6. 0mm 左右,適緊密楔人段或亞段支氣管管口,防止大氣道分泌物混入和灌洗液外溢,保證BALF 回收量。
2、在灌洗過程中咳嗽反射必須得到充分的抑制,否則易引起支氣管壁粘膜損傷而造成灌洗液的混血,同時影響回收量。
3、一份合格的BALF 標本應是:BALF 中沒有大氣道分泌物混入;回收率> 40 ％ ,存活細胞佔95 ％以上;紅細胞< 10 ％(除外創傷/ 出血因素) ,上皮細胞< 3 ％～5 ％;塗片細胞形態完整,無變形,分佈均勻。
4、由於BALF 中可溶性成分檢測受諸多檢測因素影響,如灌注量和回收量、肺泡上皮通透性等,致使肺泡襯液稀釋度亦有所不同。儘管在做BALF 可溶性成分檢測時採用內或外標記物進行標化,但檢測結果仍存在著差異,其臨床價值有限, 故本草案未做有關BALF 液性成分檢測方法的規範。
5、本規範不適於少量液體做支氣管沖洗(BL) 和全肺灌洗技術的操作。
6、健康非吸菸者BALF 細胞學檢測正常參考值:
(1) 細胞總分數:細胞總數(0. 9～0. 26) ×109/ L ,其中肺泡巨噬細胞0. 93 ±0. 03 ,淋巴細胞0. 07 ±0. 01 ,中性和嗜酸細胞均< 0. 01。
(2) T 淋巴細胞亞群:總T細胞(CD3+ ) 0. 7 ,T輔助細胞(CD4+ ) 0. 5 ,T 抑制細胞(CD8+ ) 0.3 ,CD4+ / CD8+ 比值1. 5～1. 8。
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