一、多彩歷史
如今表觀遺傳學搞得如火如荼。DNA甲基化和去甲基化其實是表觀遺傳學漫漫長河中一條支流所泛起的幾朵浪花。
DNA甲基化是較早發現和得到認可的一種表觀遺傳學修飾，就是在鹼基胞嘧啶（cytidine, C）的嘧啶環上第5位碳原子加上一個甲基基團（-CH3）。這種修飾並非發生在DNA序列所有的C上，而主要是在CG一起出現是的C上（後來發現：在胚胎幹細胞，也有很多甲基化發生其他C上）。別看這一個小小的修飾，卻給DNA增加了額外的資訊，使得有限的基因組的遺傳資訊表現呈現出豐富的多樣性。
於是會疑問，這額外的資訊究竟是些什麼？首先簡單地把DNA甲基化理解為“一把鎖”，凡是被DNA甲基化標記的部分，大都是需要被“塵封”“監禁”的基因，比如基因組的“搗蛋鬼”―轉座子，就是被甲基化這把“鎖”管制著，失去管制或管制不嚴，這些“搗蛋鬼”會在基因組裡跳來跳去，把基因組搞得一團糟，會引起很多問題，例如腫瘤的發生。
DNA甲基化最符合表觀遺傳的定義了。DNA甲基化在體細胞水平是十分穩定、且可遺傳的，也就是說，體細胞分裂形成的“子”細胞不僅繼承了“母”細胞的基因組DNA序列，還十分忠實地拷貝了“母”細胞基因組DNA的甲基化模式。但是，在生殖細胞形成過程中，還有受精卵向胚胎分化的過程中，基因組DNA的甲基化要經過一個大規模的“重塑”，而且時間視窗很短。例如，受精卵在分裂前，顯然對精子的基因組ＤＮＡ甲基化進行了一次“清洗”，在受精卵分裂後很快又開始快速重建。另外生殖細胞（精子和卵子）的形成過程中，也有甲基化重塑現象。這就提出了一個重要的基本問題：DNA甲基化在這麼短的時間內事如何被“清洗”掉的？回答這個問題的關鍵就是找到能夠將DNA的甲基化基團去掉的DNA去甲基化酶（DNA demethylase）。然而，這個問題提出容易，解決起來卻很不簡單。從提出來伊始，花了很多人十幾年的功夫，卻一直懸而未決！原因在於DNA去甲基化這個過程只限於卵子受精後分裂前和生殖細胞生成過程，時間視窗很短，細胞來源有限，無法獲得足夠數量的細胞或組織進行分子生物學操作來鑑定基因，更無法進行生化操作去純化酶，因此研究起來極其困難。多年以來這DNA去甲基化過程一直是一個很大的謎團。
問題很重要，可是“狗咬刺蝟，無從下口”。
中間有段插曲。有個加拿大的猶太裔生物學家Szyf教授made a big joke。Szyf教授是DNA甲基化領域的一個元老，然而他劍走偏鋒，最後成為這個領域的另類科學家，邊緣人物。他的實驗室發現了一個DNA去甲基化酶，發在1999年的Nature上，一時間在圈內引起轟動，但其它實驗室無法重複， Szyf在JBC上還專門給出詳細條件，但後來還是沒有人報道能夠重複，他還是堅持不懈，不停地給ＪＢＣ灌水，用不同的系統證實去甲基化酶的存在。
ＤＮＡ去甲基化的研究從此沉寂了若干年。
但是，還是有些有遠見的科學家一直還在思考這個問題，並沒有停止探索的腳步。2005年，施揚的實驗室發現組蛋白去甲基化酶和催化機制，引起轟動，這也鼓舞了人們去尋找和鑑定DNA去甲基化酶的信心。北大尚永豐實驗室報道了在卵巢癌細胞有基因特異性“主動DNA去甲基化”的現象，美國朱健康實驗室在植物發現並鑑定了ＤＮＡ去甲基化酶。然而，哺乳動物的DNA甲基化酶，依然是“猶抱琵琶半遮面”，“千呼萬喚不出來”。
2008年德國多家實驗室聯合，和法國實驗室在Nature上發表兩篇論文，報道了載體細胞內區域性性的主動DNA去甲基化過程。這時，ＤＮＡ甲基化領域的次領軍人物-哥倫比亞大學Bestor出來在Cell上帶有譏諷的口吻評論這件事(The colorful history of active DNA demethylation)。稍早些時候，海德堡的發育生物學家Niehrs在Nature上發文報道一個DNA損傷誘導蛋白Gadd45a促進DNA去甲基化，但是當即引來針鋒相對的反駁。美國加州貝克曼研究所的Pfeifer 實驗室在PLoS Genet上發文否定Niehrs的結果，題目針鋒相對，火藥味十足： GADD45A does not promote DNA demethylation!
但是，後來相繼有幾篇來自不同實驗室的報道肯定了Niehrs的結果。儘管如此，還是有些問題：１、Gadd4a基因敲除並不妨礙胚胎髮育，也不會影響受精卵分裂前的去甲基化過程，2、CADD4a 其實並不是真正的去甲基化酶，它只是啟動一種DNA修復機制，叫核酸切除修復（Nuclear acid excision repair；NER，主要用來修復紫外線對DNA的損傷），把一段甲基化的DNA切了，重新合成新鏈。這個機制在區域性或者是個別基因特異性去甲基化中發揮作用是可以理解的，作為普遍的機制，參與全基因組甲基化的重新程式設計，恐怕讓人接受不了。打個比方，如果想把牆體顏色換了，你是願意把牆上的磚拆下來換成新磚呢，還是隻是把把磚上的塗料漆除掉呢？尤其是對整棟樓的大面積換的時候？畢竟一方面是效率問題，另一方面是經濟問題。
終於迎來2009-2010，這時，DNA去甲基化酶才“千呼萬喚始出來”，正式走上舞臺中央，成為耀眼的新星。
二、峰迴路轉
DNA去甲基化酶的發現和鑑定頗能代表兩種不同的研究模式（兩種研究模式，兩個半機制，7個分子）。
研究模式一：假說驅動型研究（Hypothesis driven）
這是經典的科學研究模式，需要首先提出假說，然後設計實驗驗證之。假說很多時候都是錯的，因此對我們一般人而言也是高風險的一種策略。這種策略的成功不僅需要直覺、想象力和勇氣，還需要豐富的經驗和紮實的基礎，當然邏輯推理能力也是必不可少的。欣賞高水平的科學研究，有時會有讀福爾摩斯探案般的智力享受。在DNA去甲基化的研究上，我們可以欣賞兩個hypothesis driven 的典範。
首先出場的，是Anjana Rao，原哈佛大學病理系免疫學家，現在到了加州拉霍亞變態反應研究所，２００８被選為美國科學院院士。她原本不是表觀遺傳學圈內人，但是大家就是大家，一出手就是大手筆，就像當年施揚，原來也不是專門做組蛋白甲基化修飾的，但是靈感來了，闖入表觀遺傳學領地，還是做出了出人意料的重要發現。
Rao的想法是，DNA去甲基化可能是通過氧合（羥化或加單氧反應）的機制，這種想法可能是從一種模式生物-非洲錐蟲的研究中獲得的啟示。錐蟲中有一種酶JBP1，它可以把胸腺嘧啶的甲基加一個氧（羥化）形成羥基，然後由其它酶在這個羥基上連上一個糖基，這樣形成一種獨特的結構(被命名為J結構)，雖然沒有除去原來的甲基基團，但在基因的表達調節中發揮作用。胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶的結構十分類似（都是嘧啶環），甲基基團的位置相同，Rao推測在高等生物可能也存在類似的酶和機制。基於這個假設，他們通過蛋白序列進行多輪同源搜尋（PSI－blast），終於在人和鼠的蛋白資料庫找到了三個基因Tet1, 2, 3. 而且發現這類基因在後生動物門中都普遍存在,提示這種功能機制的重要性和保守型。
通過細胞學實驗和生化分析，他們獲得兩項極其重要的發現：1.證實這三個蛋白都對甲基化胞嘧啶具有氧合修飾作用，只是活性強度不同，這應該是他們所期望的計劃內的成果；2.甲基胞嘧啶被氧合反應催化之後形成了新的修飾形式-羥甲基胞嘧啶(Hydroxyl-methyl cytidine, hm-C)，這種修飾形式賦予DNA新的表觀遺傳學特性和資訊；這第二項發現是出乎意料的計劃外成果，可能影響更為深遠。
緊接著，他們又將工作快速推向深入，把這種修飾與造血細胞的分化聯絡到了一起(2009年Science)，然後還發現其異常（Tet2突變、缺失）與血液系統腫瘤發生密切相關（2010年Nature）。表觀遺傳學領域的一個明星人物張毅在這時候也快速介入，發現Tet1介導的羥甲基胞嘧啶修飾在維持幹細胞的自我更新（renewal）功能上發揮重要功能（2010年Nature)。
2011年，DNA羥甲基化修飾工作成為Nature的常客（Nature 18 Jul 2010；Nature 30 Mar 2011；Nature 03 Apr 2011；Nature，13 April 2011, Cell 14 April 2011）。
老夥計玩起新把戲（Old Dog, New Tricks）
這也是個典型的Hypothesis driven的研究結果。故事的主人公都是來自英國劍橋的M. Azim Surani和Wolf Reik。他們的理論模型是：甲基胞嘧啶通過脫氨作用形成的尿嘧啶，尿嘧啶只能在RNA出現，如果在DNA出現，或者被細胞認為是合成的過程中摻錯原料了，或者被認為是鹼基化學損傷，總之，細胞會觸發鹼基切除反應（base excision repair, BER），這和NER有類似的地方。這時，一個90年代初被發現在免疫系統能夠發育中發揮重要作用的分子AID（鹼基胞嘧啶脫氨酶）進入了探索DNA去甲基化酶者的視野。
AID最初是由日本著名的免疫學家本庶（Honjo T）的實驗室克隆出來的。AID的克隆和功能闡明，對B細胞發育和抗體多樣性的形成大大地向前推進。這樣一個老分子，卻被發現有了新的重要功能。M. Azim Surani和Wolf Reik這次用的系統是原始生殖細胞。在AID基因敲除細胞，這兩個實驗室都發現精子的去甲基化受到顯著影響，但仍還有部分發生，說明還有其它機制的存在。最後他們都證實AID參與的去甲基化是通過對甲基化胞嘧啶的脫氨作用啟動鹼基切除修復完成的。就像把整個大樓許多部位的某些抽出來，換上新的，雖不夠經濟節約，但是確實發生了，我們只能相信事實，而不是經驗和常識。
研究模式二：系統篩選型
如果沒有線索，沒有頭緒，沒有想法（假說）怎麼辦？撒網撈，系統地撈。
Stephen J. Elledge就是靠建立功能強大的RNAi篩選系統這張超大超強的“網”發家的。 他建立這個超級捕撈系統就像是一個超大的捕魚船，配備超大的網（把所有基因一網打盡）、自動化操作（barcode系統+基因晶片），成為功能基因組研究中的海上霸王。
要進行篩選，必須要有一個可靠又有適合篩選的觀察指標（indicator）。２００９年，北卡的張毅實驗室設計了一個巧妙的實驗，並用受精卵細胞進行篩選，併成功地打開了了一個小缺口。
首先他們設計了一個能檢測活細胞基因組DNA甲基化狀態的方法。細胞內有一類蛋白能專門識別和結合甲基化DNA（methyl DNA binding protein，MBD），如果把MBD與綠色熒光蛋白連起來（融合），相當於給MBD加上了一個熒光標籤，可以在顯微鏡下直接觀察和追蹤MBD的位置。一般情況下， MBD-GFP是與基因組上甲基化的DNA結合，在熒光顯微鏡下呈現綠色的斑點(foci)；在基因組甲基化被清除時，MBD-GFP就無處可以結合，因此就分散在細胞核內，在顯微鏡下，原來那些綠色熒光斑點消失，而變成了彌散的綠色。這樣通過觀察熒光訊號的變化來判斷基因組甲基化的變化。
有了這個判斷指標就可以篩選了。要通過RNA干擾技術，把選定的基因一個個分別“去掉”，然後通過觀察熒光訊號的變化。如果某一個基因被幹擾之後，在受精卵細胞內的熒光斑點狀訊號不消失，或消失的十分緩慢，這就提示這個基因可能參與基因組的去甲基化過程。這項篩選工作量非常大，他們篩選了４０００個基因，最後他們拿到了一個效果肯定的候選基因，原來是一個轉錄延長因子ELP3。具體什麼機理，還不清楚。最近，Johns Hopkins大學醫學院的華人科學家Song Hongjun在最新一期Cell上發表研究論文，將Tet1催化的羥甲基化反應和AID催化的脫氨反應統一了起來。
DNA去甲基化這曾經的一塊鐵板，終於被撬開；果然，下面有很多金銀財寶啊，你難道不想擠進去也搶一點麼？
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