精液蛋白17（Sp17）靶向的卵巢癌腫瘤疫苗
宋坤 孔北華山東大學齊魯醫院婦科宋坤
癌-睪丸抗原（CT抗原）是一組睪丸組織特異的蛋白質，可在多種腫瘤細胞中異常表達，而在睪丸外正常組織中表達受限。最近發現Sp17為CT抗原家族成員，是具高度免疫原性的人類自身抗原，其結構中含細胞毒性T淋巴細胞（CTL）抗原決定簇，因此可作為腫瘤免疫治療的理想靶分子。為探討Sp17作為卵巢癌免疫治療靶分子的可行性，選用三例卵巢癌患者腫瘤標本進行研究。逆轉錄多聚酶鏈反應（RT―PCR）、溴乙非啶瓊脂糖凝膠電泳顯帶檢測Sp17在腫瘤標本中的表達。密度梯度離心從外周血中分離單個核細胞（PBMCs），種植於含RPMI 1640加10%胎牛血清的培養皿中，培養基中加入粒-巨噬細胞集落刺激因子和白介素-4（IL-4）,培養7天后收穫細胞即為樹突狀細胞（DCs）。用陽離子脂質體DOTAP將從埃氏大腸桿菌中獲得的Sp17聯合蛋白傳遞給DCs，使之成為Sp17抗原遞呈細胞。新鮮外周血單個核細胞與攜帶Sp17的DCs以10：1比例混合培養，加入IL-2、自身血清和IL-7 於37℃孵育，每3～4天加入IL-2，每週加入自身PBMCs飼養細胞和Sp17聯合蛋白，4個週期後收穫T淋巴細胞用於細胞毒實驗。以EB病毒轉染的表達或不表達Sp17的自身淋巴母細胞株（LCL）和自身卵巢癌細胞為靶細胞，用標準4小時鉻釋放實驗檢測經Sp17抗原刺激的T淋巴細胞的細胞毒性。培養基中加入抗人類白細胞抗原-Ⅰ（HLA-Ⅰ）和抗HLA-Ⅱ抗體，以研究細胞毒作用對HLA的依賴性。流式細胞儀技術分析T淋巴細胞的表型和其細胞內淋巴因子的含量。
結果顯示，10個新鮮卵巢癌標本中7個Sp17陽性，Sp17表達率為70%。腫瘤組織和正常睪丸組織一樣表達豐富的Sp17分子。通過DCs將Sp17遞呈給PBMCs以及Sp17聯合蛋白的致敏作用，培育出Sp17特異的T淋巴細胞，其作為效應細胞在細胞毒實驗中可有效的殺傷表達Sp17的自身LCL。LCL細胞的溶解具Sp17依賴性，未轉染Sp17基因即不表達Sp17的LCL並不溶解（P0.00001）。另外，研究還發現靶細胞的溶解受HLA-Ⅰ限制，細胞毒作用可為抗HLA-Ⅰ單克隆抗體阻斷，抗HLA-Ⅱ單克隆抗體對細胞毒活性似乎並無影響（P0.000001），提示參與細胞毒作用的T淋巴細胞為CD8陽性，即細胞毒T淋巴細胞（CTL），同時提示患者免疫系統中存在Sp17特異的CTL。以自身腫瘤細胞為靶細胞的細胞毒實驗中，3例患者的腫瘤細胞都被殺傷，此作用也可為抗HLA-Ⅰ抗體阻斷而抗HLA-Ⅱ抗體對其無影響，再一次提示Sp17陽性腫瘤患者體記憶體在與HLA-Ⅰ相關的Sp17特異的CTL，也證明Sp17聯合蛋白可致敏識別Sp17的CTL並使其增殖，其所需濃度與表型同Sp17陽性腫瘤細胞表面的Sp17相似。用刀豆素A（CMA）和佈雷非德菌素A分別處理CTL，結果發現CMA可完全消除Sp17特異的CTL對自身瘤細胞的溶解作用，而佈雷非德菌素A對此無明顯影響。CMA可選擇性的抑制Perforin途徑的靶細胞溶解而佈雷非德菌素A可抑制Fas介導的凋亡途徑，由此證明Sp17特異的CTL是通過Perforin途徑介導靶細胞溶解的。流式細胞儀結果顯示實驗所培育的T淋巴細胞表型多為CD8陽性，與細胞毒實驗結果符合，證明效應T淋巴細胞為CD8陽性，即CTL。Sp17聯合蛋白再次刺激T淋巴細胞後，雙色流式細胞儀技術發現CTL主要產生IFN-γ和可檢測量的IL-4，與輔助T淋巴細胞1（Th1）的細胞因子圖象一致。
通過本研究，可以認為Sp17用做卵巢癌腫瘤疫苗的靶分子是可行的。
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