乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus , HBV) 是目前世界上流行最廣泛的病毒之一， HBV有較高的變異性，其原因是由於HBV的複製是通過RNA中間體（前基因組RNA）利用病毒本身的DNA多聚酶（polymerase）─DNA-P反轉錄成負鏈DNA，在反轉錄過程中，DNA-P缺乏校對酶活性，不能修正核苷酸的錯配，導致HBVDNA序列發生變異。HBVDNA至少含有4個開放讀碼框(open-reading frames，ORF)，即S區(包括S區、前S1區和前S2區)、C區(包括C區和前C區)、P區和X區。本文就HBV耐藥及防治策略的最新研究進展作一綜述。
一、HBV 分子結構及複製週期
HBV屬於嗜肝DNA 病毒, 其基因全長僅3. 2 kb。在HBV包膜內, HBV 基因以不完全雙鏈環狀DNA 形式存在。HBV 感染人體肝細胞後,將包膜內HBV DNA 釋放入肝細胞核內並形
成共價閉合環狀DNA(cccDNA) 。宿主RNA 聚合酶以cccDNA為模板,轉錄成mRNA。mRNA 亦為前基因組RNA。HBV 多聚酶以前基因組RNA為模板,逆轉錄合成負鏈HBVDNA ,然後再以負鏈DNA 為模板合成正鏈HBV DNA。最終形成子代HBV DNA。由此可見, HBV 多聚酶在HBV 複製過程中起著至關重要的作用。
二、HBV 耐藥突變的定義及命名
病毒對抗病毒藥物的耐藥分為表型耐藥和基因型耐藥。表型耐藥是指、在治療期間病毒水平上升，一般用抗病毒藥物濃度（IC50）測定，IC50增加說明藥物敏感性下降或耐藥程度增加，需要更大的藥物劑量才能抑制變異的病毒。基因型耐藥是指病毒聚合酶基因突變，形成新的病毒基因序列，一般採用DNA測序、基因晶片等方法測定。發生變異的病毒常可改變其生物學特性，給臨床的防治帶來一系列問題。針對HBV耐藥可分為表型耐藥、基因型耐藥、臨床耐藥，臨床耐藥( clinical resistance)指臨床出現病毒複製不能被抑制,或HBV 複製一度被抑制後又出現HBV DNA反跳, 同時並伴有ALT 升高。
已知核苷類藥物耐藥突變均發生在HBV多聚酶(DNA-P)上。HBV 分為8 個基因型(A～H) 。各基因型HBV多聚酶長短不盡相同。以A基因型HBV 為參照,HBV 多聚酶總長845 個氨基酸。HBV多聚酶可分為4 個功能區: 終端蛋白(terminal protein) 、間隔區 (spacer) 、逆轉錄酶區( reverse transcriptase) 及RNA 降解酶區 (RNase H) 。HBV 耐藥變異以國際通行的氨基酸單字母加變異位點來標記。例如, YMDD 代表逆轉錄酶區的4 個氨基酸(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸) ,其中的蛋氨酸(M) 變為亮氨酸(V) 或異亮氨酸( I) 則會引起拉米夫定耐藥。起初,HBV 耐藥突變的位置是從HBV多聚酶的第一個氨基酸數起。由於HBV 8個基因型的HBV多聚酶長短不同,以不同HBV 基因型為參照, YMDD 所處的位點不同。同樣的YMDD 變異被報道成M552V、M550V、M539V 等不同命名。為避免混亂,Stuyverg 等提議將HBV 耐藥突變統一從逆轉錄酶功能區(各基因型均為344 個氨基酸) 的第一個氨基酸數起並加字首rt (例如YMDD 變異被命名為rtM204V) 。HBV多聚酶逆轉錄酶區包含7 個基因保留亞區(A～ G) 。拉米夫定耐藥突變主要發生在B 和C 亞區中。HBV多聚酶逆轉錄酶的三維結構猶如一隻半張開的右手。B 和C 亞區均位於手掌部位,緊靠拉米夫定結合位點。rtM204V 或rtM204I 突變是引起拉米夫定耐藥的一個直接因素。從分子結構上講,V 和I 均比M多了一個β甲基。而這個多出來的甲基造成拉米夫定結合位點的空間擁擠,從而使拉米夫定不能有效地與HBV多聚酶結合。
三、HBV 耐藥突變的機制
由於HBV 在體內複製的過程需要經過逆轉錄這一步驟, 在反轉錄過程中，DNA-P缺乏校對酶活性，不能修正核苷酸的錯配，導致HBVDNA序列發生變異，HBV 複製中的天然複製錯誤率比其它DNA 病毒要高10倍左右。HBV 基因在複製過程中不斷產生天然變異,因而在HBV 感染者體內常形成一群由基因十分相似、但不完全等同的病毒株組成的準種(quasispecies) 。在未接受過核苷類藥物治療的患者中, HBV野型株佔HBV 準種的絕大多數。耐藥變異株在患者用藥前就可能存在,也可在用藥過程中產生。患者用藥後,對藥物敏感的野型病毒株受到抑制。含有耐藥突變的病毒株得以有更多空間進行復制。當對某一藥物有耐藥性的病毒株成為準種中的主要病毒株時,此藥就失去療效。
四、主要HBV耐藥突變
治療乙型肝炎的核苷類藥物主要是通過與HBV 多聚酶的天然底物(dNTP) 競爭來達到抑制HBV多聚酶的活性,從而達到抑制HBV 複製的作用。
P基因區是HBV基因組中最大的ORF，全長2496bp，編碼含832個氨基酸的多肽，稱為HBVDNA多聚酶(DNAP)，位於nt2357～0～1621之間。HBV耐藥株的變異發生在DNAP基因的rt區。臨床研究已發現有各種不同藥物的H B V 耐藥變異株，根據核苷（酸）類似物耐藥變異株的不同形式，可將現有的藥物分為三組、
（1 ）L-核苷（酸）類似物組包括拉米夫定(Lamivudine ，LMV)、依曲西他平 (Emtricitabine，FTC)，替比夫定(Telbivudine，LdT)、克拉夫定（Clevudine，CLV）；
（2 ）無環磷酸酯組，包括阿德福韋(adefovir dipivoxil，ADV)和替諾福韋（tenofovir，TFV）；
（3）環戊烯組，包括恩替卡韋(entecavir，ETV)等。
1、 L- 核苷（酸）類似物組
DNA聚合酶C區亞結構域（motif）是HBV進行逆轉錄的活性部位，由酪氨酸（Y）、蛋氨酸（M）－天門冬氨酸（D）－天門冬氨酸（D）即YMDD組成，該部位正是LAM干擾HBV複製的結合位點。研究證明，YMDD中的rt204位蛋氨酸可被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）取代，生成YVDD或YIDD，導致該亞結構域的空間構型改變，從而妨礙了與LAM的結合。YIDD變異可單獨存在，而YVDD則常伴有多聚酶B區rt180位的亮氨酸(L)由蛋氨酸(M)取代的變異。變異後的HBV對LAM的敏感性顯著下降。與拉米夫定有關的主要耐藥變異位點為rtM204I/V，目前研究已發現與耐藥有關的不同型別的突變形式包括：
（1 ）r t M 2 0 4 I / V +rtL180M；
（2）rtM204I；
（3）rtV173L +rtL180M + rtM204V；
（4）r1L80I + rtM204I；
（5）rtQ215S + rtM204I/V + rtL180M；
（6）rtIl69T + rtV173L + rt 180M + rtM204V ；
（7）rtA181T ；
（8）rtT184S + rtM204I/V± rtL180M；
（9）rtM204S + rtL180M。
其中一部分變異是作為補償突變可增強病毒的複製活性或耐藥性，一部分變異會影響到隨後的治療選擇。其他L-核苷（酸）類似物的耐藥特點與拉米夫定相似，主要變異位點集中於rtM204I/V伴隨有一些其他位點的變異。
2、無環磷酸酯組
阿德福韋耐藥變異位點集中於P 基因D 區rtN236T位點和（或）B區rtA181V/T，與拉米夫定耐藥主要集中於rtM204位點不同，阿德福韋耐藥變異位點較為分散，除了上述兩個位點變異之外，還發現有rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A、rtQ215S及rtV214A等。由於阿德福韋耐藥突變形式與拉米夫定不同，因此阿德福韋耐藥患者可應用拉米夫定或其他L-核苷（酸）類似物治療，拉米夫定耐藥也可採用阿德福韋治療。T F V 對拉米夫定耐藥毒株有效，但在同時感染H I V和H B V 的患者中發現有對T F V 及拉米夫定同時耐藥的變異株，該變異點位於B區和C區結合位點rtA194T，同時出現有rtL180M+rtM204V突變。這種聯合突變株對TFV藥物敏感性下降10倍以上。
3、環戊烯組
恩替卡韋耐藥的突變形式主要有兩種，均發生於拉米夫定耐藥的患者、
（1 ）rtM250V ±rtI169T + rtM204V + rtL180M，
（2）rtT184G+ rtS202G/I + rtM204V + rtL180M。新近發現rtV173L變異。
五、HBV耐藥的防治
1、乙型肝炎病毒耐藥變異的預測因素:
多種因素可預測HBV對核苷(酸)類似物發生耐藥機率。如治療開始時HBV DNA載量高、有肝纖維化/肝硬化基礎、曾接受過核苷(酸)類似物抗病毒治療、耐藥病毒株的適應能力強均提示高耐藥風險。越來越多的研究提示早期病毒學應答情況也是預測耐藥發生率的重要指標。
2、乙型肝炎病毒耐藥變異的預防策略:
( 1）合理選擇核苷(酸)類似物抗病毒治療的適應證:對免疫耐受期或非活動期HBV感染者,尤其是年齡較輕者,如不需要接受免疫抑制劑或化療藥物治療,則不建議應用核苷(酸)類似物。
( 2）合理選擇抗病毒治療方案:治療方案參考中國“慢性乙型肝炎防治指南”。應密切觀察患者治療期間病毒學的應答情況。此外,應儘量避免單藥序貫治療,以免多藥物耐藥的發生。
（3）提高患者的依從性:在用核苷(酸)類似物進行抗病毒治療期間,要反覆強調遵醫囑按時、足量服藥。
3、定期監測應答情況,及時調整治療方案:
治療期間每3個月檢測一次HBVDNA水平,如非依從性差所致,對原發性治療失敗或發生病毒學突破者要及時進行基因型耐藥檢測,並鑑定變異模式,以指導換用其他治療方案。HBV DNA水平的動態變化是早期發現耐藥變異的重要指標。但分析結果時需注意不同實驗室和不同檢測方法的敏感性有所差異。
4、已發生耐藥變異的臨床處理建議:
對少數治療前ALT正常、肝組織學檢查炎症或纖維化病變輕微( < G1S1)者可停止抗病毒治療,但需密切監測,一旦有肝炎突發,及時再抗病毒治療;對絕大多數核苷(酸)類似物耐藥者,尤其是失代償期肝硬化患者,需及早進行挽救治療( rescue therapy) 。通常病毒學突破先於生物
化學突破,在生物化學突破前進行挽救治療可使患者免於發生肝炎突發、肝病惡化。挽救治療需根據病毒對不同核苷(酸)類似物耐藥特點加用或換用無交叉耐藥的核苷(酸)類似物；如無禁忌證,亦可選用IFN2α或聚乙二醇化干擾素。拉米夫定耐藥加用阿德福韋或換用恩替卡韋；阿德福韋耐藥且拉米夫定初治患者應加用拉米夫定、或換用替比夫定或恩替卡韋 ；替比夫定耐藥處理與拉米夫定基本相同；恩替卡韋耐藥加用阿德福韋或換用IFNα。
六、HBV變異的檢測方法
HBV變異主要的檢測方法有
1、PCR擴增法、PCR擴增-限制性酶切片斷多型性分析(PCR-RFLP)是目前國內實驗室常用的YMDD變異、rtA181V阿德福韋酯耐藥、BCP區變異位點的檢測方法。實時熒光PCR擴增是近期國內應用較多的HBV耐藥檢測方法。
2、基因晶片分析、包括流體晶片技術、探針雜交技術，主要通過逆向斑點雜交技術實現對變異位點的檢測。
3、焦磷酸測序法、對血清標本的重複性及可靠性檢測顯示，質粒標準品的突變檢出率及重複率為100％，而血清標本為98.8％。
4、基因克隆與測序、採用特異性引物對所在目的片斷進行克隆後測序，通過與標準株的比較識別變異位點。這是所有檢測方法中最為客觀的檢測方法，但操作複雜、成本高、耗時長是該方法的主要缺陷。
七、結語
自然界的任何物種都存在變異(mutation)，變異是生物適應環境和維持生存的一種重要方式，是生物進化的規律，對遺傳進化起到重要的作用。HBV具有較高的複製率，據估計H B V 病毒顆粒平均每天產生量為1 012～13個，一個複製週期中每10 5個核苷出現一個錯配，這樣每天就有1010～11個錯配發生，而大部分突變為沉默突變，無生物學意義，HBV的變異性是如此之高，以致於沒有兩株病毒的核苷酸序列完全相同。HBV在其感染慢性化過程、免疫應答、疫苗接種、病毒藥物治療等因素影響下進行變異的優勢選擇，以實現物種生存的目的。近來的研究表明，宿主的免疫壓力對HBV 基因突變的產生和選擇起了重要作用。總之，HBV 變異後對乙肝診斷、治療、預防都產生重大影響，HBV 持續感染中各ORF 發生的突變不是孤立的，可發生多位點突變。目前研究人員又成功破譯了HBV 基因組新的編碼基因―前―前―S 基因和前―X 基因。這樣，HBV 基因組的ORF增加到6 個。除此之外，HBV 基因組還包括其他一些參與病毒複製的調控元件，包括4 個啟動子，2 個增強子，包裝訊號ε等。因而對待HBV 變異必須從全基因組出發、用發展的眼光看侍HBV變異，從各個角度全方位分析，這樣才能正確分析病情，避免臨床出現漏診，盲目用藥和延誤治療現象發生，以致於患者病情加重。只有正確對待HBV 各位點的變異，才能判斷抗病毒藥物的選擇及疾病預後，從而為患者個性化診療提供依據。
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