膀胱腫瘤具有易復發的生物學特徵，術後用藥物膀胱腔內灌注治療能明顯改善預後。但化療仍存在許多問題，其中多藥耐藥(MDR)是化療失敗的重要因素之一，因此MDR成為近年來腫瘤臨床和基礎研究中的熱點。多種因素可引起MDR，其中人們研究最多、最廣的是P-糖蛋白機制，蛋白的表達受多種因素的影響，本實驗在基因的水平上觀察多藥耐藥基因(MDR-1mRNA)的表達及對臨床生物學行為的影響。
1、資料與方法
1.1 研究物件
全部標本均取自本科1998年1月至1998年12月間住院患者手術切除的膀胱腫瘤組織，術前經膀胱鏡檢查發現，並經病理學檢查證實。病理型別：本組30例均為膀胱移行細胞癌，按WHO病理組織分級：G110例，G213例，G37例。初發的腫瘤16例，經化療藥物膀胱內灌注後復發的腫瘤14例。
正常對照為術中在膀胱腫瘤基底部2 cm以外的正常膀胱粘膜，均為術中切除並經組織學檢查為正常者。
1.2 組織標本的採集及貯存
全部標本均在手術時切取膀胱腫瘤時收取，取材時避免取到腫瘤中心的壞死組織，實驗選用手術後2 h內的鮮活標本或標本取材後立即放入-70 ℃超低溫冰箱中儲存待檢。
1.3 主要試劑
AMV逆轉錄酶購自Promega公司，TaqDNA聚合酶購自中國科學院遺傳所。
1.4 主要儀器
Gene Cycler PCR儀(B10-RAD，USA)。
1.5 多藥耐藥基因(MDR1)表達水平的檢測
採用定量RT-PCR方法進行。
1.5.1 組織總RNA的提取：樣品中總RNA提取採用異硫氰酸一步法進行，提取的總RNA加入50～100 μL DEPC去離子水溶解後，取部分樣品經甲醛凝膠電泳檢測鑑定其質量，並用紫外分光光度計測定A260及A280，計算A260/A280，比值均大於1.8，根據A260計算其RNA含量。
1.5.2 通過逆轉錄反應(reverse transcription)合成cDNA。逆轉錄反應在一個50 μL的反應體系中進行，反應體系中包含總RNA 5 μL，隨機引物(Random Primer)0.5 μg RNA酶抑制劑(Rnasin 40 U，AMV 10 U，dNTP 40 μL)。在42 ℃水浴1 h，完成RT，在95 ℃水浴中5 min，將酶滅活後立即置冰浴中，加DEPC 50 μL，製備出用於PCR的cDNA的模板。
1.5.3 PCR擴增反應：PCR擴增反應採用兩對寡核苷酸引物，其一為MDR-1mRNAcDNA引物，引物序列：MDR-1mRNA正義：5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′;反義：5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTCA-3′。內對照引物β2微球蛋白參照文獻設計，5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′-ATCTTCAAACCTCCATGATG。
1.5.4 PCR結果判斷：PCR產物經電泳分離後，陽性樣品應有三條帶，分子量大小分別為300 bp和170 bp，其中300 bp為內標b2-MG，而170 bp產物則為MDR-1mRNA基因。兩條帶強度之比(MDR-1mRNA/b2MG)為MDR-1mRNA基因表達相對值，據此相對值，即可以判斷各樣品中MDR-1mRNA表達程度的差異。
2、結 果
應用上述RT-PCR條件，對30例膀胱腫瘤的標本和26例正常膀胱粘膜組織進行了檢測。26例正常膀胱粘膜標本中MDR-1mRNA的表達為15.4％。30例膀胱腫瘤中MDR-1mRNA的陽性率為17/30(56.7％)，其中G1、G2、G3腫瘤陽性率分別為40％、61.5％、71.4％。16例初發腫瘤標本陽性率為37.5％，14例化療後復發腫瘤標本陽性率為78.6％。
結果提示正常膀胱粘膜組織有MDR-1mRNA的表達，MDR-1mRNA的表達與腫瘤的分化程度有關。化療後復發腫瘤MDR-1mRNA表達有明顯增強。
3、討 論
膀胱腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性是膀胱腫瘤術後化療的主要障礙。臨床上許多腫瘤在經歷了最初有效的化療之後，最終仍難免於復發，其主要原因是腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。與MDR1基因相關的常用化療藥物包括烷化劑類(如BCNU，ME-CCNU等)，植物鹼類(如長春新鹼、長春花鹼、VM26等)，抗生素類(如絲裂黴素、阿黴素、博來黴素等)，激素類(如地塞米松等)。
這些藥物通常為分子量較大的親脂性化合物，是膀胱腫瘤治療中常用的藥物。當腫瘤細胞對上述其中一種藥物發生耐藥時，即可同時對其他各類藥物發生交叉耐受，因此，膀胱腫瘤中MDR1基因的表達對化療藥物的耐藥性密切相關。
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