淋病是我國流行性病中的主要病種。雖然其他性病發病人數的增加，使淋病在整個性病病人中的比例已由1991年的65.2％下降到2000年的33.3％，但淋病患者的總人數卻由11.4萬上升到28.6萬，發病率也由10.09/10萬上升到22.92/10萬。
一、淋球菌耐藥現狀
抗生素依然是治療淋病的主要藥物，但由於我國治療性病的醫療市場很不規範，致使淋球菌耐藥菌株增多，如淋球菌對青黴素的耐藥菌株已達68.3％，對四環素的耐藥菌株達92.6％，使這兩種藥已退出淋病的治療方案。喹諾酮類藥物中的環丙沙星是近些年才用於淋病治療的，但耐藥菌株的比例迅速上升。據全國性病麻風病控制中心淋球菌耐藥監測協作組報告，1995～2000年6年間，淋球菌對環丙沙星的耐藥菌株分別為15.5％、13.5％、28.5％、52.3％、78.2％和85.2％。在檢測的4188株淋球菌中，對環丙沙星耐藥的菌株為2232株，佔53.3％。在臨床上也發現很多用環丙沙星治療淋病失敗的病例。
二、淋球菌耐藥性的問題
在臨床上遇到的細菌越來越多的是耐藥的，因此越來越多的抗生素不起作用，究其原因是細菌的基因發生了改變，改變的方式有很多，越簡單的生物越容易變異。
1、常用抗生素
根據化學結構, 常用的抗生素可分為: β-內醯胺類、氨基糖甙類、大環內酯類、多烯類、四環素類、磺胺類、喹諾酮類等。
抗菌藥對微生物的抑制或殺滅作用，主要通過5個作用位點：1.抑制細菌細胞壁的合成，對細菌具有選擇性毒性的藥物為β-內醯胺類(青黴素類、頭孢菌素類、碳青黴烯類)、糖肽類(萬古黴素、替考拉寧);2. 抑制細菌蛋白質合成，具有選擇性的藥物為大環內酯類、四環素類、氯黴素類、氨基糖苷類;3.抑制葉酸合成，具有選擇性的藥物為磺胺類、甲氧苄啶;4. 影響核酸代謝，藥物如喹諾酮類、利福平、甲硝唑，選擇性毒性較差;5.破壞細胞膜結構，藥物如兩性黴素B、多粘菌素，選擇性毒性差。
2、淋球菌耐藥性的分類
遺傳性耐藥性(天然耐藥)：染色體性耐藥性(染色體介導)、染色體外性耐藥
性(質粒介導)和非遺傳性耐藥性(獲得性耐藥)：多為質粒介導。
3、淋球菌耐藥性的傳遞方式
淋球菌質粒介導和染色體介導將基因從一個細菌到另一個菌體的傳遞方式有幾種：
(1)轉化(transduction)：
指一般外源性基因進入菌體，並整合到宿主菌的染色體中。所有的淋菌都可以吸收、整合，表達來自其他菌體的DNA。所以淋球菌都具有轉化能力。有菌毛淋球菌的轉化能力明顯高於無菌毛淋球菌變異株。有菌毛的淋球菌在其生長過程中的任何時期都可以發生轉化。淋球菌可以被質粒的和染色體的DNA所轉化;
(2)結合：
結合是淋球菌遺傳資訊進行交換的另一種形式。當淋球菌在互相接觸時進行DNA轉移交換。配對結合過程和遺傳資訊的交換是由一個非常巨大的、24.5兆道爾頓的質粒所介導的。這種質粒能夠在不同的淋球菌菌株之間轉移其耐藥質粒。耐藥質粒的轉移不僅可發生在淋球菌之間，也可以發生在淋球菌和其他型別的細菌之間，包括其他奈瑟菌以及大腸桿菌之間轉移。所以，結合對於體內耐抗生素質粒的擴散是十分重要的，它對研究質粒交換的機制十分有意義;
(3)轉導(conjugation)、轉位(translocation)或轉座(transposition)：
轉導指供體細菌的DNA通過噬菌體傳給受體細菌，再通過重組嵌入受體菌的DNA中。轉位或轉座指質粒之間或質粒和染色體之間發生一段DNA順序的交換，從而產生耐藥。在淋球菌遺傳物質交換可能的機理研究中，人們目前只發現了轉化和結合這兩種方式。
淋球菌的耐藥可由染色體引起，也可由耐藥性質粒引起。隨著遺傳學和分子生物學發展，人們對淋球菌染色體介導的耐藥機制認識越來越清楚。目前認為染色體介導的耐藥有兩種型別，一是藥物作用靶位點基因單步突變，二是涉及數個藥物作用靶位點基因的突變，不同位點的聯合突變決定耐藥的程度和方式。
目前對染色體介導耐藥性的研究主要集中在多個位點突變上，這些位點包括青黴素結合蛋白基因(penA、penB)、DNA螺旋酶A基因(gyrA)、拓撲異構酶Ⅳ的C亞基基因(parC)、多重可傳遞耐藥系統基因(MtrR、MtrC、MtrD、MtrE)和孔蛋白基因(porin, pIA/pIB)等。這些研究結果的獲得是國內外研究者採用“功能克隆法” 首先克隆與抗生素作用靶位點或代謝的耐藥性相關的有關基因，如penA、penB、gyrA、parC、Mtr(MtrR、MtrC、MtrD、MtrE)和porin(pIA/pIB)，然後進一步分析出現耐藥性表型菌株的相應基因序列的改變情況。
許多研究已經證實氟喹諾酮耐藥淋球菌菌株存在多種耐藥機制。因此，淋球菌的耐藥性可能屬於多基因控制的性狀。然而，究竟有多少基因在淋球菌耐藥性中起作用，是否存在更重要的耐藥相關基因，是值得我們作深入研究的課題。
淋球菌對常用抗生素有不同的耐藥率及耐藥機制：對青黴素耐藥的主要機制是產生β-內醯胺酶;對四環素耐藥的主要機制是細胞膜對藥物的通透性降低;對大環內酯類、大觀黴素耐藥的主要機制是作用靶位的改變;對氟喹諾酮類耐藥的主要機制是gyrA及parC基因的突變;對第三代頭孢菌素類敏感性降低或耐藥的機制尚未明確,但與penB、penA等基因密切相關。
三、淋球菌耐藥機制
1、耐藥質粒
淋球菌特異的耐藥性可以由染色體和質粒的基因改變引起, 按淋球菌的耐藥性一般將淋球菌分成以下幾型:PPNG 質粒介導的產青黴素酶的淋球菌;TRNG質粒介導的耐四環素淋球菌;PPNG/TRNG質粒介導的對青黴素和四環素都耐藥的淋球菌;CMRNG染色體介導的對青黴素和四環素都耐藥的淋球菌;QRNG染色體介導的對喹諾酮類耐藥的淋球菌。
1976年首次分離出帶有β-內醯胺酶的耐青黴素淋球菌菌株，研究表明這種耐藥性是通過質粒介導耐藥的，對青黴素(Penicillin)和氨苄青黴素(Ampicillin)耐藥。目前PPNG在世界各地播散，非洲和亞洲的許多地區PPNG佔50％或更多，給淋病的治療帶來了相當大的困難;1983年美國分離出了β-內醯胺酶陰性由染色體介導的耐藥菌株(Chromosomally mediated resistant Neisseria gonorrheae)，(簡稱CMRNG);1985年首次鑑定出質粒介導的高度耐四環素菌株(TRNG)，它是由耐鏈球菌決定簇Tetm進入淋球菌內，並停留在部分結合質粒衍化而來的新質粒上，該新質粒可傳遞並具有啟動某些β-內醯胺酶質粒的能力。TRNG對四環素、二甲胺四環素和強力黴素耐藥。近年又出現耐狀觀黴素的菌株。PPNG、CMRNG和TRNG的區域性地區暴發，已證實係一種營養血清菌型，防治應集中控制耐藥菌株。
人類對淋球菌質粒的研究始於本世紀70 年代。1973年美國的Englkirk首次從一例淋病患者中檢測到2.6MD隱蔽性質粒, 以後陸續檢測到耐青黴素質粒(非洲型3.2～3.4MD、亞洲型4.4～4.7MD和3.05MD多倫多型質粒)、高度耐四環素質粒(25.2MD)和接合型質粒(24.5MD)。研究表明: 接合型質粒與耐藥性質粒在菌株間的播散有密切的關係, 它能夠在不同的淋球菌之間甚至淋球菌與其它細菌之間轉移其耐藥質粒。
25.2MD質粒攜帶TetM基因,介導高水平耐四環素。過去認為此質粒是由24. 5MD 質粒獲得TetM基因而形成, 但Gascoyne等報道, 這兩種質粒的限制酶圖譜明顯不同, 目前認為24. 5MD 質粒和25. 2MD質粒並無同源性。
24.5MD質粒與4. 4MD 耐青黴素質粒密切相關, Lind 等報道, 81％ 帶4. 4MD 質粒的PPNG同時具有24.5MD質粒, 表明24.5MD質粒可能和4. 4MD 質粒傳遞有關。耐藥質粒可通過轉化和接合兩種方式在菌株間傳遞。在轉化實驗中, Graves 發現只有同源質的片段才能被攝入, 因此質粒的轉化需識別特異的DNA 序列。淋球菌表面可能存在特異性受體。對質粒轉化的進一步研究將有助於更清楚地瞭解耐藥質粒廣泛傳播的機制。
2.6MD 隱蔽性質粒可在大多數菌株中檢測到,其意義不清。Korch 等的實驗證明, 淋球菌的隱蔽性質粒能整合於細菌染色體上(包括無質粒菌株) , 重組菌可發生菌毛, 外膜蛋白等抗原性的改變。
淋球菌攜帶質粒存在明顯的地區差異性。淋球菌質粒攜帶率除了具有地區差異以外, 耐青黴素質粒還具有高度多樣性。這些質粒與淋球菌耐藥性的關係尚不清楚
2、淋球菌血清學分型的研究
人們應用不同的方法積極地瞭解耐藥菌株的分佈、頻率、來源及流行病學特徵。
tapsall等對悉尼1991～1995年從97例淋病患者中分離的氟喹諾酮敏感性降低(76株)及耐藥(21株)淋球菌的表型特徵進行了研究。營養型/血清型(A/S)分型結果顯示，97株淋球菌分屬27種A/S型，其中10株(10％)為IA血清型，分屬5種不同的A/S型。87株為IB血清型分屬於22種不同的A/S型。全部耐藥菌株屬於IB血清型，其中14株環丙沙星MIC8μg～16μg/ml的淋球菌有6種不同的IBA/S型。表型有多樣性提示不同亞型的淋球菌均能產生氟喹諾酮耐藥性。
Kam等對香港1991年1月至1995年1月從氧氟沙星治療失敗患者中分離的69株耐藥菌株與另外143株敏感菌株的血清型和抗生素敏感性譜進行了對比研究。69株耐藥菌株分屬21個血清型，絕大多數(67/69)為IB血清型，BoP及Bpy為主，點92.7％。在喹諾酮耐藥性選擇過程中，大多數IA及其他的IB血清型減少。
日本分離的31株耐氟喹諾酮淋球菌屬於11個血清型，全部為WⅡ/WⅢ血清群(即IB血清型)。各種亞型的淋球菌在gyrA和parC中出現與喹諾酮耐藥相關的改變。這些研究表明，在澳大利亞、香港、日本出現的耐氟喹諾酮淋球菌是由於gyrA和parC基因發生改變的菌株在體內的多克隆選擇，某些IB血清型菌株似乎更易被選擇。
應用協同凝集試驗研究德國海德堡地區1985年～1990年間淋球菌血清學分型的變化。結果649株淋球菌標本血清學分型檢測顯示,在已知的24種特異性蛋白A(PIA)和31種特異性蛋白B(PIB)中分別檢出8種和26種血清型,其中最常見的6 種血清型分別為IB-3(19.0％)、IB-4(16.0％)、IB-2(15.7％)、IB-1(13.1％)、IA-1/2(11.7％)和IA-6(3.2％)。此外,我們還發現一種未知的PIB ,其血清反應圖象為3C8,1F5, 2D4。結論該地區淋球菌的血清型仍以IB佔大多數。
3、產生抗生素的滅活酶
一些臨床使用的β-內醯胺類抗生素如:青黴素(PC)和頭胞菌素(CS)都含有β-內醯胺。β-內醯胺類抗生素選擇性地作用於細菌胞壁,β-內醯胺環能與合成粘肽的轉肽酶結合,使轉肽酶尚失活性,進而抑制細胞壁的合成,而該類藥物對無細胞壁的動物細胞毒性較小,因此β-內醯胺類藥物常用於淋病的臨床治療。
有些淋球菌可以通過產生β-內醯胺酶來形成β-內醯胺類抗生素的耐藥性,該酶是多種型別不同的以β-內醯胺環為底物的降解酶,它可以使抗生素抗菌作用減弱或消失。
其作用機制:青黴素酶或頭胞菌素酶的活性中心均為蛋白質多肽鏈中的絲氨酸,它作為親核劑和β-內醯胺環的羧基結合,形成醯化酶中間體,在其與H2O分子的作用下導致β-內醯胺環失活,這是淋球菌對β-內醯胺類抗生素產生耐藥性的一個重要原因。
4、改變現存作用的靶位點
淋球菌可以通過抗生素作用的靶蛋白或靶酶產生改變而產生耐藥性,該機制主要包括有青黴素結合蛋白(penicillinbind-ingproteinsPBPs)、DNA螺旋酶A亞基(gyrA)及拓撲異構酶 的C亞基(parC)的改變。
4.1 青黴素結合蛋白(penicillinbind-ingproteinsPBPs)
PBPs引起的耐藥是質粒介導的，耐藥質粒能夠編碼合成β-內醯胺酶，而破壞青黴素的結構。
PBPs是一些位於細胞膜上的酶類,包括:肽聚糖轉肽酶、葡萄糖轉基酶、羧肽酶,對維持細菌胞壁的穩定起著重要作用,同時也是β-內醯胺類抗生素的主要靶位點,通常致病淋球菌有相對較為簡單的PBPs模式,按照蛋白質電泳條帶主要可分為3種,分別為PBP1(87000KD)、PBP2(59000KD)、PBP3(44000KD),其中PBP1、PBP2是重要的抗生素靶作用位點。β-內醯胺類抗生素是通過專一性地與淋球菌細胞膜上PBPs結合, 干擾細胞壁肽聚糖的合成，影響細胞壁的合成來殺滅淋球菌。敏感的淋球菌菌株中PBP2 能100％與青黴素結合;對於耐藥的淋球菌菌株，PBP2 則只有25％與青黴素結合。然而PBP2 親和力的變化是染色體上Pen A 位點突變的結果
在淋球菌的耐藥機制中,已知ponA、PenA等基因是編碼PBPs的基因,當ponA及PenA基因突變時,可以使相應氨基酸序列發生改變如批PBP1突變(Leu-421→Pro)及PBP2突變(Asp-345a插入),從而影響到淋球菌與β-內醯胺類抗生素的結合力,使β-內醯胺類抗生素對細胞壁的醯化速度下降3～4倍,因此起到了增強細菌耐藥性的效果。
4.2 DNA螺旋酶(gyrA)及拓撲異構酶(parC)的改變
有些氟喹諾酮類抗生素的作用靶部位是細菌的DNA螺旋酶,該酶是一種Ⅱ型DNA拓撲異構酶，在DNA複製、重組及轉錄中起重要作用。DNA螺旋酶的A亞基由gyrA基因編碼,這一基因的突變可造成藥物靶位點A亞基發生改變,影響它與藥物結合的能力,使淋球菌表現出對該類藥物耐受性。
Yoshda等人曾將帶有耐藥菌株的gyrA基因的質粒匯入正常的淋球菌株中,結果表明敏感菌株也對藥物產生了耐藥性,其它學者通過藥物梯度平板篩選也發現gyrA的基因突變可以使淋球菌的耐藥性明顯增強。
在Deguchi的進一步研究中發現耐藥菌株gyrA的基因中主要有91、95密碼子的突變,造成91位TCG(絲氨酶)變成TTC(苯丙氨酸)及95位GAC(天冬氨酸)變成AAC(天冬醯胺),在parC上也出現了86、87、88、91位點的突變,而在藥物敏感菌株沒有此突變,這一研究表明gyrA及parC位點改變是淋球菌重要的耐藥機制。
Belland等人還對耐藥菌株gyrA和parC的關係進行了深入研究,結果發現:gyrA位點突變是淋球菌最重要耐藥機制,該位點的突變可以引起低水平及中等水平的耐藥,而parC的突變對淋球菌的耐藥起輔助作用,gyrA突變與parC突變的共同作用引起較高水平的耐藥性。
4.3 DNA螺旋酶改變與細胞內類藥物累積量的減少的協同
細胞內藥物累積量的減少也參予耐藥性的產生，但其作用相對較小。細胞內藥物累積量的減少可能與細胞內膜的主動外排系統有關。例如在氟喹諾酮敏感性降低的臨床分離株中觀察到氟喹諾酮攝取量及累積量下降。在實驗室選擇性突變株研究中發現，不存在gyrA和parC基因突變時，細胞內氧氟沙星累積量降低的突變株氧氟沙星MIC值較親代菌株高16倍;gyrA單位點突變伴細胞內藥物累積量減少的突變株MIC值增高128倍;gyrA和parC均有突變伴細胞內藥物累積量減少的突變株MIC值增高256倍。伴有或不伴有藥物累積量下降的耐藥突變株在外膜蛋白特徵上無顯著差異。
5、對藥物的外排機制
淋球菌的耐藥機制中Mtr外排系統(Mtreffluxsystem)起著重要作用。這一系統決定了淋球菌對脂溶性因子(HAs)的敏感性,其中包括:脂肪酸、膽鹽、脂溶性抗生素等。
Doughterty在1986年就發現,除了PPNG由prc質粒介導的耐藥性之外,還存在另一類耐藥的淋球菌,它們不產生β-內醯胺酶,但是這類淋球菌菌株均有Mtr基因系統的變異。
Mtr系統(mutipletransferableresistance)即多重可傳遞耐藥系統,該基因系統是1個多重可傳遞耐藥操縱子,主要由1個抑制子MtrR基因和3個結構基因MtrC、MtrD、MtrE基因構成,它們可以分別編碼相應的蛋白質(MtrR、MtrC-MtrD-MtrE),其中MtrC-MtrD-MtrE是細胞膜上的脂蛋白。MtrC是膜融合蛋白;MtrD是外排蛋白,位於細胞膜上;MtrE是外膜通道蛋白,位於細胞膜外;MtrR是調控蛋白,對MtrCDE的轉錄起抑制作用。
該系統與大腸桿菌細胞膜上的AcrAE及EnvCD蛋白泵及綠膿桿菌細胞膜上的MexABOprK蛋白泵十分相似。淋球菌的Mtr基因複合體是一個由MtrC-MtrD-MtrE細胞膜蛋白構成的主動外排蛋白泵,MtrC-MtrD-MtrE複合物能有效將各種結構不同的抗生素、脂溶性因子(HAs)主動運出細胞體外,整個過程由細胞膜上脂蛋白在ATP酶催化下完成。淋球菌通過這種能量依賴系統主動地泵出抗生素分子來阻止藥物在細胞內的蓄積,因而抗生素無法達到其發揮選擇性細胞毒作用所需要的濃度,故該類淋球菌可以表現出對抗生素的多重耐藥性。
Mtr外排系統對淋球菌的多重耐藥性的調節可分為兩種機制:
1、MtrR依賴調節機制
在MtrR依賴調節機制中已知MtrR基因共有630bp,位於MtrCDE基因的上游250bp處,MtrR基因可以編碼一個有210氨基酸組成的蛋白。該蛋白為一種阻遏蛋白,作為轉錄抑制子對MtrCDE基因的表達起調節作用。MtrR基因的鹼基一旦發生突變會導致MtrR抑制蛋白的合成減少,使MtrR基因下游的MtrCDE基因轉錄增強,造成細胞膜中的MtrCDE蛋白增多,進而造成了淋球菌Mtr外排系統對抗生素的主動外排功能。
2、非MtrR依賴調節機制
另外,在MtrR基因與MtrC基因之間的啟動子區域有一段13bp的迴文結構(5’-AAAAA-GACTTTTT-3’),當這一回文結構中3’端的最後一個鹼基T/A缺失時,會影響MtrR和MtrC基因的表達,從而提高了淋球菌對抗生素的耐藥性,為非MtrR依賴調節。有資料表明,淋球菌的這一機制引起的耐藥性要明顯強於MtrR依賴調節機制的耐藥性。
近來發現淋球菌細胞膜上還存在另外一種系統,即Far系統,該系統對長鏈脂肪酸及一些脂溶性因子有耐受性,但有學者研究發現雖然Far系統和Mtr系統獨立對各種脂溶性因子及抗生素起作用,但是Far系統仍需依靠外膜通道蛋白MtrE,同時也會受到MtrR蛋白的調控。
6、細胞膜通透性的改變
細胞膜通透性發生改變是淋球菌的一個重要耐藥機制,抗生素和其它複雜的分子一樣必須通過脂多糖外膜通道進入細胞,這一條通道由孔蛋白(porin)提供,抗生素通過這條通道的能力會受到其形狀、大小、電荷的影響,一旦孔蛋白髮生變異,細菌易產生耐藥性。
淋球菌的外膜蛋白至少有三種，其中蛋白I為主蛋白，佔外膜蛋白的60％，不同淋球菌的蛋白I的抗原性不同。該抗原性質穩定，故可以以此製成單克隆抗體對淋球菌進行血清學分型。它以兩種形式表達即PIA和PIB。它可在細胞膜上形成孔道。使水溶性物質、其他對細菌代謝有重要作用的物質及某些抗生素可通過細胞膜進入細胞內。蛋白Ⅱ與淋球菌同人類上皮細胞、白細胞的粘合及細胞間的粘合有關，具有熱修飾性。蛋白Ⅲ具有還原修飾性，又稱Rmp，有強免疫原性，與同種其他奈瑟氏菌有交叉反應，能阻斷其他抗體的殺菌作用。
淋球菌的外膜蛋白PIA和PIB的表達下降或者完全不表達時,進入細菌胞質的抗生素的數量就會減少,淋球菌就會表現出對抗生素的耐受性。
7、淋球菌的適應及其它免疫逃避機制
表面成分的變異包括菌毛變異、Opa蛋白變異、LPS變異;利用宿主的成分，如淋球菌生長需要鐵離子，表達識別轉鐵蛋白和乳鐵蛋白的受體，利用機體的鐵。有研究表明，細菌的鐵獲得系統亦為基本毒力因子。此外還有細菌內生存、血清抗性等免疫逃避機制。
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