探討宮清顆粒對人早孕絨毛、蛻膜組織細胞凋亡及訊號轉導的影響,為臨床防治藥物流產後異常子宮出血(簡稱藥流後出血)提供生物學依據。方法:將120例受試者隨機分為宮清藥流組、茜芷藥流組、單純藥流組及負壓吸宮組,各30例,收集各組絨毛及蛻膜組織,觀察細胞超微結構變化;TUNEL法檢測細胞凋亡率(AR)、熒光分光光度計檢測細胞內鈣離子濃度([Ca2+] i)、免疫組化法檢測蛋白激酶C(PKC)蛋白表達。
結果:宮清藥流組絨毛、蛻膜組織細胞超微結構出現典型凋亡改變,AR、[Ca2+] i升高, PKC蛋白表達降低,與其它3組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。結論:宮清顆粒能影響細胞內Ca2+及PKC介導的細胞訊號轉導,誘導人早孕絨毛、蛻膜組織細胞凋亡,促進絨毛與蛻膜組織完全排出,進而防治藥物流產後出血。
藥物流產具備安全、痛苦小等優點,但存在出血時間長、出血量多等問題,個別病例出血時間長達1～4個月,並有6％～10％的不完全流產率及潛在大出血危險。中藥複方宮清顆粒組方是長期應用於臨床的有效方劑,已獲國家藥品監督管理局新藥臨床研究批件,並順利完成Ⅱ期臨床研究。本研究從細胞凋亡及訊號轉導角度探討宮清顆粒防治藥物流產後出血的作用機制,為臨床應用提供生物學依據,豐富中醫學“產後多虛多瘀”理論的科學內涵。
資料與方法
一、研究物件
受試物件120例,均為2006年5月～2007年10月就診于山東中醫藥大學附屬醫院婦科門診者,根據《中華婦產科學》、《婦產科診療常規》、《中藥新藥臨床研究指導原則》有關內容擬定病例納入與排除標準。按照隨機數字表,採取隨機分組雙盲法,將受試物件分為宮清藥物流產組(A組)、茜芷藥物流產組(B組)、單純藥物產流組(C組)及負壓吸宮流產組(D組),每組各30例。
二、藥物與試劑
米非司酮(國藥準字H20000628,批號050501)及米索前列醇(國藥準字H10960144,批號050309),均由上海華聯製藥有限公司生產。宮清顆粒由浙江愛生藥業有限公司生產(國家藥品監督管理局新藥臨床研究批件2003L01386)。
三、服藥方法
1.A組 按藥物流產常規方法服用米非司酮和米索前列醇。服米非司酮第1d開始服宮清顆粒, 48g/d,分3次服用,連服3d。
2.B組 服米非司酮第1d開始服茜芷膠囊(甘肅蘭藥藥業有限公司生產), 15粒/d,分3次服用,連服3d。
3.C組 藥物流產常規方法服用米非司酮及米索前列醇,不服中藥。
4.D組 行負壓吸宮流產術。
四、組織學分析
1、取材 收集A、B、C組服藥後排出的新鮮絨毛各30例和蛻膜組織各20例,D組手術時取得的絨毛和蛻膜組織各30例,立即用生理鹽水衝淨,常規固定。
2、透射電鏡下細胞超微結構觀察 環氧樹脂(812)包埋,超薄切片機切片,厚度約60nm,醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色。JEM-1200EX透射電鏡觀察,拍照。
3、TUNEL法檢測細胞AR 標本切片HE染色後,脫蠟,蛋白酶K室溫孵育20min;滴加50μl的TUNEL反應混合液,於溼盒中37℃孵育60min;加入50μl轉化劑POD, 37℃孵育30min;經DAB顯色、蘇木素核覆染後脫水、透明、封片。以上各步驟均用PBS沖洗,陰性對照用不含末端脫氧核苷酸轉移酶的TUNEL反應液孵育。影象定量分析:TUNEL陽性反應物定位於細胞核,呈棕黃色,著色陽性細胞為凋亡細胞[6]。隨機選取10個非重疊視野(×100),陽性細胞所佔百分率為AR。
4、熒光分光光度計檢測[Ca2+] i 日立F-4500型熒光分光光度計設定激發光光柵5nm,發射光光柵10nm,測定溫度為37℃。以光譜方式測定Fura-2/AM標準液和負載液的激發光譜,其最大波長由380nm降到340nm,說明Fura-2/AM負載進入細胞內。以時間方式測定(激發波長340nm)Fu-ra-2負載液熒光強度(F值),加入10％TritonX-100,終濃度為0. 1％, 30min後檢測最大熒光強度Fmax,加入EDTA,終濃度為5mmol/,l 30min後測得最小熒光強度Fmin。[Ca2+] i(nmol/L)=Kd(F-Fmin/Fmas-F),Kd為Fura-2與Ca2+反應的解離常數, 37℃時224nmol/L。
5、免疫組化法檢測細胞PKC蛋白表達變化 標本切片脫蠟, 3％H O 室溫孵育10min;漂洗後微波爐抗原修復; 10％正常山羊血清封閉後加一抗孵育4℃過夜;漂洗後滴加辣根酶標記二抗, 37℃孵育30min; DAB顯色劑顯色後;自來水充分沖洗,復染,封片。採用Leica QW in V3影象分析軟體分析結果,蛋白表達強弱與灰度值大小呈負相關,即蛋白表達越強則灰度值越低。
五、統計學方法
採用SPSS12.0統計學軟體,計量資料結果用均數±標準差( ±s)表示,先採用方差齊性檢驗,再用組間兩兩比較q檢驗、秩和檢驗進行組間差異的比較,計數資料用x2檢驗。
結 果
一、一般情況
經統計學分析, 4組觀察物件在年齡、生育情況、停經天數及孕囊大小等方面差異無統計學意義,具有可比性。
二、絨毛、蛻膜組織細胞超微結構觀察(圖略)
1、D組 合體滋養細胞、蛻膜細胞表面微絨毛豐富,細胞滋養細胞基底膜正常,滋養細胞、蛻膜細胞核形態正常,核內染色質分佈均勻,細胞器正常,顆粒細胞內有大量電子密度高的分泌顆粒,細胞間連線緊密。
2、C組 合體滋養細胞、蛻膜細胞表面微絨毛脫落,細胞滋養細胞基底膜增厚,滋養細胞與蛻膜細胞核形態不規則,核膜腫脹,出現常染色質團塊狀,異染色質邊集,核固縮等凋亡形態學改變。顆粒細胞內分泌顆粒明顯減少,細胞間連線縫隙增寬。
3、B組 合體滋養細胞、細胞滋養細胞、蛻膜細胞及顆粒細胞超微結構變化與C組相似。
4、A組 出現凋亡形態學改變,程度較C、B組加重,合體滋養細胞、細胞滋養細胞、蛻膜細胞及顆粒細胞均出現典型凋亡小體,其內包含結構基本正常的細胞器。
三、AR、[Ca2+] i和PKC的變化
A組絨毛滋養細胞及蛻膜組織細胞AR、[Ca2+] i升高,絨毛及蛻膜組織細胞PKC灰度值升高,與其它3組比較差異均有統計學意義(P<0.05),說明A組PKC蛋白表達較其它組降低。
表1 絨毛滋養細胞AR、[Ca2+] i和PKC的變化(
±s)
組別
例數
AR(％)
[Ca2+]i
PKC灰度值
A組
30
3.02±0.20*▲▲△
125.37±6.40*▲△△
135.71±3.82*▲△
B組
30
2.89±0.19*
120.33±7.58*
133.73±3.81*
C組
30
2.87±0.21*
119.91±6.80*
133.17±3.70*
D組
30
2.17±0.23
109.03±7.84
127.51±3.73
*與D組比較P<0.01 ▲與C組比較P<0.05 △與B組比較P<0.05 ▲△與C組比較P<0.01 △△與B組比較P<0.01
表2 蛻膜組織細胞AR、[Ca2+] i和PKC的變化(
±s)
組別
例數
AR(％)
[Ca2+] i
PKC灰度值
A組
20
3.13±0.18*▲△
130.65±7.46*▲△
142.80±4.93*▲△
B組
20
3.02±0.14*
125.14±8.04*
139.17±4.94*
C組
20
2.99±0.19*
124.42±7.96*
138.25±5.18*
D組
30
2.83±0.15
110.31±7.53
131.45±4.03
*與D組比較P<0.01 ▲與C組比較P<0.05 △與B組比較P<0.05
討 論
近年研究認為藥物流產後子宮異常出血與絨毛、蛻膜細胞凋亡不足有關,而米非司酮作用後的絨毛和蛻膜組織細胞表現出凋亡傾向,本研究結果與報道相一致。中藥對細胞凋亡具有調節作用已得到證實,活血化瘀藥能誘導細胞凋亡,調節細胞增殖與凋亡平衡,清熱藥、補益藥能誘導腫瘤細胞凋亡,但尚未見有關於中藥誘導人早孕絨毛、蛻膜組織細胞凋亡預防藥物流產後出血的研究報道。
本研究觀察4組婦女流產後人早孕絨毛、蛻膜組織細胞超微結構變化,發現宮清顆粒用於藥物流產後絨毛、蛻膜組織細胞凋亡程度較其它3組高,且該組絨毛、蛻膜AR明顯高於其它組,提示宮清顆粒有誘導藥物流產人早孕絨毛、蛻膜細胞凋亡的作用。為進一步探討宮清顆粒這一作用機制,我們對參與細胞生命活動的關鍵,第二信使Ca2+及其重要靶分子蛋白PKC進行了研究。
Ca2+是各條細胞訊號傳導途徑的樞紐,有證據表明[Ca2+] i升高可引起細胞凋亡。近年來,有關藥物流產細胞凋亡的研究逐漸深入,但對參與細胞凋亡訊號轉導的重要因子Ca2+超載的研究未見報道。我們首次將[Ca2+] i納入流產藥物對細胞凋亡影響的研究,發現宮清顆粒能升高絨毛、蛻膜[Ca2+]i提示宮清顆粒可能通過影響Ca2+介導的訊號轉導,誘導人早孕絨毛及蛻膜發生細胞凋亡。在訊號通路中PKC是細胞內Ca2+作用的重要靶分子蛋白,它在細胞的生長、分化與凋亡中起重要作用。
PKC活化後通過對靶蛋白分子的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化而介導多種生物效應,它能使G蛋白的活化因磷酸化而下調,引起環磷酸腺苷(cAMP)水平增高,誘導細胞凋亡。也有報道PKC活化引起細胞內cAMP水平升高,促進轉錄導致細胞增殖和分化。研究發現米非司酮抑制早孕滋養細胞PKC訊號轉導通路及raf-1瀑布激酶鏈和分裂啟用蛋白,抑制增生分裂並誘導凋亡。本研究發現宮清顆粒用於藥物流產後絨毛滋養細胞、蛻膜組織細胞PKC蛋白表達降低,提示宮清顆可能通過降低PKC蛋白表達,抑制細胞分化增值,誘導凋亡。
中醫認為藥物流產乃人為終止妊娠,藥物流產後陰血驟虛,氣不攝血;或胎墮不全,餘血留滯胞宮,瘀血不去,新血難安;或外邪乘襲釀而化熱,熱傷血絡;或三者相互交錯,虛實並存,以致惡露不淨。“瘀、虛、熱”是本病的主要病機,活血祛瘀是治療本病的關鍵,瘀去而血行,養血益氣是治療本病的基礎。
宮清顆粒君藥益母草活血祛瘀,清熱止血;臣藥馬齒莧、生蒲黃、牛膝助君藥活血化瘀,涼血止血;佐藥當歸、黨蔘養血益氣,活血化瘀;使藥甘草補中益氣,調和諸藥;實驗證實該藥能協同米非司酮抗早孕,提高完全流產率,縮短陰道出血時間,減少陰道出血量,不影響卵巢排卵功能及月經恢復;藥效學實驗表明宮清顆粒能明顯興奮子宮平滑肌,縮短出凝血時間、增加雌激素含量,有抑菌和鎮痛作用,並發現該藥有誘導絨毛細胞凋亡傾向。
通過本研究發現該方能誘導人早孕絨毛、蛻膜組織細胞凋亡,促進絨毛與蛻膜組織完全排出,進而防治藥流後出血。對Ca2+和PKC介導的細胞訊號轉導的調節可能是其作用機制之一。但細胞內Ca2+的來源及其在誘導絨毛、蛻膜組織細胞凋亡中的確切機制尚未明確,此方向的深入研究將進一步揭示本病發病機理及藥物防治機制。
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