研究盆腔炎顆粒對混合菌加機械刺激所致大鼠慢性盆腔炎的抗炎抗粘連作用機理。方法:以混合細菌加機械刺激法複製大鼠慢性盆腔炎模型,隨機分為正常組、模型組、假手術組、盆炎淨組及盆腔炎顆粒大、中、小劑量組,造模2周後,各治療組灌胃給藥2周,以酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-10、IL-8、MCP-1的濃度。
結果:盆腔炎顆粒可以顯著降低模型大鼠血清IL-1β、IL-8、MCP-1水平,並顯著升高血清IL-10水平,且大、中劑量組接近正常組水平。結論:盆腔炎顆粒對模型大鼠的抗炎抗粘連作用的機理可能是降低血清前炎症因子及趨化因子水平,同時升高抗炎症因子水平,從而恢復炎症因子平衡,減輕區域性炎症反應和纖維增生。
盆腔炎顆粒;慢性盆腔炎;炎症細胞因子;趨化因子
慢性盆腔炎是婦科常見病、多發病,臨床以腹痛、帶下、盆腔組織增厚、粘連、包塊形成為主要特徵,常常反覆發作,纏綿難愈,其防治已成為婦科領域迄待解決的重要課題。盆腔炎顆粒是臨床應用療效肯定的藥物,本研究在前期實驗研究基礎上,觀察了盆腔炎顆粒對模型大鼠血清炎症細胞因子和趨化因子的影響,藉此探討活血補腎法抗炎及抗黏連的部分作用機制。
1、材料與方法
1. 1實驗動物
健康雌性未交配的SD大鼠70只。體重180~220g,山東大學動物實驗中心提供,許可證號: SCXK魯20030004。
1. 2實驗藥物
盆腔炎顆粒(丹蔘、赤芍、菟絲子、生蒲黃、炒五靈脂、連翹等),由山東中醫藥大學附屬醫院製劑室提供;盆炎淨顆粒(忍冬藤、雞血藤、益母草、川芎、狗脊等),由昆明積大製藥有限公司生產,生產批號:國藥準字Z20013124,批准文號: ZZ-4368-滇藥準字(1996)第003301號。
1. 3實驗試劑
菌種:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌以2∶1∶1的比例溶於無菌生理鹽水配成濃度為15×109/mL的混合細菌懸液,由山東省衛生防疫站菌種室提供。白介素-1β(IL-1β)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10),單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)酶免試劑盒購自美國ADL公司。
1. 4實驗方法
1. 4. 1模型複製 大鼠適應性飼養3天后,於第4天以混合細菌注射法造模。戊巴比妥鈉(濃度為0. 4％ )腹腔注射麻醉大鼠(50mg/kg)後,無菌條件下,取大鼠下腹正中切口約0. 8~1cm,開腹後暴露並固定子宮,用1mL注射器抽取0. 2mL混合細菌懸液,在注入菌液之前用注射器機械損傷子宮內膜組織,然後注入菌液至雙側子宮內,縫合切口。假手術組麻醉後開腹,雙側子宮內各注射0. 1mL無菌注射用水後關腹。
1. 4. 2分組及給藥 從65只大鼠中隨機抽取8只為正常組,其餘52只參加造模,其中隨機抽取8只為假手術組。造模過程中因麻醉過量等原因死亡6只,剩餘大鼠造模後飼養14天,進行分組,隨機分為模型組、盆腔炎高劑量組、盆腔炎中劑量組、盆腔炎低劑量組、盆炎淨組。
造模後飼養2周,開始給藥。治療組分別給予盆腔炎顆粒配製液(100mg/mL),高劑量組大鼠2g/kg,中劑量組大鼠1g/kg、低劑量組大鼠0. 5g/kg;盆炎淨組給予盆炎淨顆粒配製液(54mg/mL)灌胃,每隻大鼠540mg/kg。模型組給予2mL的生理鹽水灌胃,正常組正常飼養,不給任何處理。每日1次,連續給藥14天。
1. 4. 3 指標檢測 末次用藥24h後,固定動物,心臟取血3~4mL,離心(3000r/min) 10min取上清液分裝,置於-30℃以下儲存備用。血清中細胞因子IL-1、IL-8、IL-10及MCP-1濃度檢測採用酶聯免疫吸附法,嚴格按照試劑盒操作說明書進行。脫頸處死大鼠,肉眼觀察各組子宮大體變化,摘取雙側子宮,置10％福爾馬林固定液中固定、常規切片、HE染色、光鏡下觀察子宮組織病理形態變化。
1. 4. 4統計方法 結果用SPSS 16. 0軟體進行統計,採用單因素方差分析,各組間比較採用q檢驗。
2、結果
2. 1 盆腔炎顆粒對模型大鼠血清IL-1βIL-10水平的影響
實驗結果顯示,模型大鼠IL-1β水平較正常組顯著上升(P<0. 01),而IL-10水平顯著下降(P<0. 01)。盆腔炎顆粒各劑量組均可不同程度地降低IL-1β水平,升高IL-10水平,且中、大劑量組接近正常水平(P>0. 05)。盆腔炎顆粒大劑量組IL-1β水平較盆炎淨顆粒組顯著降低(P<0. 05)。見表1。
表1盆腔炎顆粒對模型大鼠血清IL-1β IL-10水平的影響(pg/mL,
±s)
組別
n
IL-1β
IL-10
正常對照組
8
35.73±4.43??
42.43±4.48? ?
模型組
8
45.88±4.93※※
27.35±2.99※※
假手術組
8
36.43±3.74??
41.23±4.68? ?
盆炎淨組
8
41.01±3.69? ?※
36.75±3.87? ?
盆腔炎大劑量組
9
36.49±3.09? ?△
39.32±4.00? ?
盆腔炎中劑量組
9
38.82±2.44? ?
39.97±3.81? ?
盆腔炎小劑量組
9
40.58±3.61?※
35.71±3.72※※??
注:與正常對照組比較,※P<0. 05,※※P<0. 01;與模型組比較,?P<0. 05,? ?P<0. 01;與盆炎淨組比較,△P<0. 05,△△P<0. 01;下同。
2.2 盆腔炎顆粒對模型大鼠血清IL-8MCP-1水平的影響
實驗結果顯示,模型大鼠IL-8和MCP-1水平均較正常組顯著升高(P<0. 01),盆腔炎顆粒各劑量組均可不同程度地降低IL-8、MCP-1水平,中、大劑量組接近正常水平(P>0. 05),作用程度與劑量相關。盆腔炎顆粒中、大劑量組IL-8、MCP-1水平較盆炎淨顆粒組顯著降低(P<0. 05或P<0. 01)。見表2。
表2盆腔炎顆粒對模型大鼠血清IL-8 MCP-1水平的影響(pg/mL，
±s)
組別
n
IL-8
MCP-1
正常對照組
8
22.47±1.96? ?
19.04±1.89? ?
模型組
8
31.50±2.67※※
26.05±2.27※※
假手術組
8
22.57±2.98? ?
18.08±1.82? ?
盆炎淨組
8
25.87±2.45? ?※
22.90±2.02? ?※※
盆腔炎大劑量組
9
21.14±2.96? ?△△
20.66±1.66? ?△
盆腔炎中劑量組
9
23.22±2.11? ?△
21.63±1.68? ?
盆腔炎小劑量組
9
27.00±3.32※※? ?
24.37±2.07※※
注:與正常對照組比較,※P<0. 05,※※P<0. 01;與模型組比較,?P<0. 05,? ?P<0. 01;與盆炎淨組比較,△P<0. 05,△△P<0. 01;下同。
3、討論
已有研究認為,部分慢性盆腔炎在慢性發展過程中已經無病原體的存在,慢性階段的病理改變是繼細菌感染後的免疫反應所致,與免疫因素如相關細胞因子、炎性介質、自由基及細胞凋亡等因素的異常改變有關。炎症細胞因子因其功能可被分為兩大類:前炎症細胞因子如白介素-1, IL-8,腫瘤壞死因子-α等;抗炎症細胞因子如白介素-4、IL-10、轉化生長因子-β等。前炎症細胞因子可以促進炎症的發展,而抗炎症細胞因子可抑制炎症反應及促進組織的修復和再生。兩者的平衡將影響組織創傷及炎症的發展和結局。
細胞因子本是機體正常防禦反應的重要參與成分,但當刺激過於強烈,細胞因子產生過度時,它們又可產生廣泛的損傷作用。IL-1是一種單核因子,是巨噬細胞分泌的主要細胞因子之一,是炎症發動因子之一。IL-1分為IL-1α、IL-1β,大多數刺激劑刺激條件下, IL-1βmRNA水平要高於IL-1αmRNA數倍。IL-1β能通過啟用中性粒細胞和內皮細胞等進一步促進炎性因子的釋放,併產生氧自由基、蛋白酶、花生四烯酸等代謝產物,形成級聯式瀑布效應,致使內皮細胞受損。
單核趨化蛋白-1(MCP-1)和IL-8既是趨化因子,也是前炎症因子。MCP-1屬於C-C類趨化因子,主要趨化單核細胞和T淋巴細胞,誘導單核細胞、內皮細胞表達黏附分子,使各種炎性細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集。IL-8是一種很強的中性粒細胞趨化因子,屬於C-X-C類趨化因子,它能促進中性粒細胞的溶酶體及超氧陰粒子、白三烯及5羥色胺的釋放,通過增加單核細胞黏附分子的表達,增強其遊走能力;同時IL-8又是一種前炎症因子,中性粒細胞與IL-8接觸後發生形態變化,定向遊走到反應部位並釋放一系列活性產物,導致機體區域性炎症反應,達到殺菌和損傷細胞的目的。
IL-10是一類非常重要的內源性抗炎因子,主要由T細胞產生,是炎症負反饋調節環中的關鍵成員,具有減輕炎症細胞過度活化狀態的作用,在促炎因子啟用的同時, IL-10也被啟用,並廣泛抑制多種促炎細胞因子如TNF-a、IL-1β、IL-6等的合成[4]。IL-10能夠抑制單核細胞依賴性Th細胞增生,並抑制Th1類細胞因子的合成及其活性,尤其抑制干擾素(IFN-γ)的產生。有研究發現IL-10下調炎症因子表達的作用是通過抑制IκB激酶的活性、削弱核因子κB(NF-κB)與DNA特定位點的結合能力等環節實現的。
此外,這些炎症因子也和纖維化和粘連形成有著密切的關係。IL-1對內皮細胞的血管形成活性、成纖維細胞的增殖和膠原合成都有廣泛的作用;創傷後IL-1釋放並與受體結合,通過自分泌及旁分泌方式,促進表皮細胞、成纖維細胞的增殖與膠原合成。IL-8可調節子宮內膜基質細胞基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性。Mulayim等研究認為, IL-8可增加體外培養的子宮內膜基質細胞(ESC)的MMPs的活性並增加其侵襲能力。
IL-8還可以誘導子宮內膜細胞與纖維連線蛋白的黏附,而子宮內膜細胞與纖維連線蛋白和膠原蛋白的黏附又可以誘導IL-8的表達,這兩者互相促進,進一步促進腹腔炎症的發展。而IL-l0能抑制纖維化過程的進展,其機制可能為IL-10不足時可上調I型膠原的合成並促進膠原蛋白酶基因表達重構細胞外基質,亦可使促纖維化因子TGF-β的產生無法有效抑制等相關。
盆腔炎顆粒是治療慢性盆腔炎的有效藥物,根據中醫“久病多瘀”、“久病及腎”的理論,以活血化瘀,補腎培元立法,臨床用於治療血瘀腎虛型患者療效顯著,前期研究已表明本藥物可改善患者體液免疫及細胞免疫。
本實驗結果顯示盆腔炎大鼠IL-1β、IL-8、MCP-1水平顯著高於正常組, IL-10水平顯著低於正常組,表明在慢性盆腔炎病理過程中,前炎症因子和抗炎症因子之間的平衡被打破,前炎症因子包括趨化因子產生過量,同時缺乏抗炎症因子作用的對抗,導致炎症不斷髮展引起組織的損傷和纖維增生,而盆腔炎顆粒各劑量組則不同程度地降低了前炎症因子及趨化因子的水平,並升高了抗炎症因子IL-10的水平,並使各炎症因子接近正常水平,即重新恢復了前炎症因子和抗炎症因子之間的平衡,從而減輕區域性炎症反應和纖維增生。
由此推斷盆腔炎顆粒可能是通過使失衡的炎症因子網路恢復平衡而發揮其抗炎及抗粘連作用的,這也可能是活血補腎法治療本病的部分作用機制。
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