一、大腸癌肝轉移概況
肝臟是大腸腫瘤最常見、最易發生的轉移器官。據報道，美國每年新發現的大腸癌約15萬人，其中1/4-1/3病例屬於晚期，即TNM分期的IV期。在上述這些晚期大腸癌的病例中，發生肝轉移者佔50％-70％。1990年據美國癌症協會統計，當年患結直腸癌死亡的人數為6.1萬，其中近4萬人死於肝轉移。
在初次就診時，大約10％為Duke’s A期，20％-30％為B期，30％-40％為C期，其餘則為已轉移病人。其中最主要的轉移器官是肝臟。大約60％的病人在第一次確診大腸癌時就存在有轉移灶。而在原發病灶手術切除後5年內，還可以有50 ％病人發生肝轉移。有學者報告：大腸癌病例死亡後屍檢時，肝轉移可達36％-81％[3]。這種高的發生率，可能是影響大腸腫瘤總的治療水平的一個重要因素。
關於大腸癌肝轉移不經任何治療的自然生存期，總的說來很短，平均生存期為6～10個月，中位生存期為4.5個月或6.6個月，甚至有的報道半年生存率為0[1]。上述情況充分說明大腸癌肝轉移如不積極治療，預後是較差的，是大腸癌主要死亡原因之一。
遺憾的是，絕大多數病人確診時由於肝轉移灶過大，與大血管關係密切及肝內多發轉移灶等原因，只有20％左右的肝轉移患者適合手術治療[4]。據目前現狀看來，單純依靠改進手術技巧很難提高手術切除率。只有通過早期發現肝轉移的存在，才有可能儘早地進行治療，從而提高生存率，改善預後。
二、大腸癌肝轉移形成的機制
大腸癌肝轉移的形成是一個複雜的過程，涉及腫瘤細胞和宿主之間多因素的作用。其轉移的主要過程包括：
1、侵襲細胞外基質 在原發灶部位，癌細胞之間的粘附力降低，癌細胞表面電荷密度增加，相互排斥力增大，細胞易移動，腫瘤細胞分泌的各種酶類(如絲氨酸蛋白酶、基質金屬蛋白酶)消化細胞外基質，易於與基底膜粘附連線，導致腫瘤細胞突破結締組織構成的屏障。
2、 進入門靜脈系統 癌細胞與基底膜及血管內皮細胞粘附，血管內皮細胞骨架受到影響，細胞間隙增大，在基質金屬酶、肝素酶、胞漿素、彈力蛋白酶、尿激酶等作用下，癌細胞穿過血管內皮及基底膜，進入門靜脈系統。
3、癌細胞在迴圈中存活 進入血液的癌細胞，大部分被宿主殺死，部分處於休眠狀態，一小部分具有高轉移潛能的細胞亞群能與血管內皮粘附，穿出管壁，形成轉移灶。
4、癌細胞在肝臟內增殖 癌細胞在穿出血管後能否在一個新的微環境下生長，轉移灶最終形成的關鍵。癌細胞只有在適宜的肝內微環境條件下微血管增殖，才能形成肝轉移瘤[7]。
大腸癌肝轉移的形成與癌細胞的生物學特性、機體的免疫狀況及肝臟的微環境有關。只有各方面條件都滿足的情況下，癌細胞才能在肝臟形成轉移灶。CRC肝轉移的形成可簡單表示為：大腸癌原發灶-門靜脈系血-肝臟-肝靜脈入肺迴圈到全身(或入膽汁)。
三、大腸癌肝轉移相關分子標誌
浸潤和轉移得益於一些蛋白的參與，如刺激腫瘤細胞和宿主細胞或細胞外基質粘附;腫瘤細胞對宿主屏障如基底膜的蛋白水解，腫瘤細胞的定向移動，以及在靶器官內的克隆性生長。
(一)細胞粘附相關的受體的改變
1、鈣粘蛋白-連線蛋白系統: β-連線蛋白(β-catenin)是一種細胞骨架蛋白，與鈣粘蛋白(E-cadherin)的C端相結合，N端結合α-連線蛋白(α-cat)，形成E-cad/β-cat/α-cat複合體，由α-cat連於肌動蛋白絲[8] 。E-鈣粘附蛋白/連線蛋白複合體是維持上皮細胞的極性、形態和組織結構完整的主要粘附分子。複合體功能的喪失，瘤細胞間粘附性降低，易於脫離，侵入周圍組織。有研究表明β-catenin的缺失與大腸癌的肝轉移相關 [9]。
2、癌胚抗原(CEA)： CEA是一種高度糖基化的細胞表面糖蛋白，為免疫球蛋白超家族成員之一，是一種腫瘤細胞的粘附分子，在大腸癌的復發轉移中起重要作用,。在大腸癌肝轉移的早期檢測中應用最廣泛[10]。肝臟Kupffer細胞上有CEA受體，並誘導Kupffer細胞分泌細胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、TNFα)。可誘導肝竇內皮細胞表達細胞間粘附分子，從而增加了腫瘤粘附並滯留於肝臟[11]。
3、CD44：腫瘤細胞表面的粘附因子CD44是一種跨膜透明質酸受體，介導與內皮細胞的粘附。其變異體CD44v6、 CD44v8-10的高表達被認為與大腸癌肝轉移的關係十分密切[12,13]。CD44剪接變異體可能通過促進腫瘤細胞與血管內皮細胞和細胞外基質的粘附、促進腫瘤細胞向基質侵襲，影響腫瘤細胞骨架蛋白的聚集和分佈，從而影響腫瘤細胞的遷移和運動能力，幾方面共同作用從而影響腫瘤轉移的形成[14]。腫瘤細胞表達CD44變異體可以在轉移過程中逃避宿主免疫系統的識別而免於被清除。
4、整合素(integrin)：這類分子主要介導細胞與細胞外基質(ECM)的粘附，使細胞內骨架與細胞外基質得以整合而形成整體，也參與細胞與細胞間的粘附。它主要通過識別精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽位點介導粘附作用。Takamura H等用免疫組化實驗結果顯示58％(11/19)存在肝轉移的大腸癌組織整合素αVLA3染色陽性，較非轉移組織(0％)明顯增高。整合素α3β1增高，提示可能在大腸癌肝轉移中起重要作用。
5、 唾液酸化的路易斯寡糖-X(Sialyl Lewis-X，sLex)抗原：SLX也是內皮性血細胞粘附分子-1(Endothelial leucocyte adhesion molecule-1, ELAM-1)的配體,作為肝血管內皮細胞表面E-selectin受體的配體，在大腸癌肝轉移中起重要作用。高表達sLex抗原的腫瘤細胞由原發灶脫落，進入血管，粘附於肝血管內皮上生長，並形成肝轉移瘤，更易浸潤基底膜，粘附於啟用的人血管內皮細胞，形成肝轉移。研究證實大腸癌轉移灶中sLex抗原表達強於原發灶中sLex抗原的表達[18,19]。
腫瘤相關抗原CA 19-9 和 sLex 在整個結腸都有表達。隨著結腸癌從非轉移性向轉移性腫瘤演進時這些糖抗原也升高， sLex是結腸癌細胞趨於轉移的普遍特徵。某些與血清抗原相關的抗原也與腫瘤演進相關聯。CA19-9抗原在腺瘤和結腸癌中的水平比正常粘膜顯著為高。其他凝集素如乳糖結合性凝集素或半乳糖結合性凝集素-3(galectin-3)也與腫瘤性轉化和轉移演進有關[20, 21]。
(二)蛋白酶類改變
腫瘤細胞自基底膜或細胞外基質脫離，細胞蛋白酶降解基底膜或細胞外基質浸入淋巴管或血管構成浸潤及轉移。細胞外基質(ECM)降解蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、彈力蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等。其中金屬蛋白酶家族(MMPs)被認為是一組最重要的蛋白酶，是抗腫瘤轉移的一個重要靶點。在結直腸癌中研究最多的是基質金屬蛋白酶和尿激酶等，
1、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteases, MMP) MMP為一金屬依賴性內肽酶(endopeptidase)，對ECM中的各種成分有蛋白酶活性。由特異性金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP)和膜結合的膜型MMP(membrane-type matrix metalloproteinase，MT-MMP) 所調節。
MMP可分為以下幾組：膠原酶(或明膠酶)、溶基質酶(stromelysin)、溶基質素(matrilysin)和MT-MMT。最重要的膠原酶為MMP-2 和-9, 它可水解ECM的膠原。正常結腸組織中的MMP只存在在血管中的中性粒細胞和集合淋巴小結的巨噬細胞中。在癌腫中MMP-2 和-9的量較高，並與Dukes分期相關.
2、 纖溶酶原/纖溶酶系統 纖溶酶啟用物 (plasminogen activator) DeBruin等證明正常結腸粘膜尿激酶型纖溶酶啟用物 (urokinase- type plasminogen activator, uPA)活性很低而組織型纖溶酶啟用物(tissue- type plasminogen activator, tPA)活性卻較高，但結腸癌中正好相反，結腸腺瘤中的活性則介於兩者之間。
uPA表達水平與預後呈負相關，並有人證明uPA蛋白水平與腫瘤的血管生成顯著相關。尿激酶型纖溶酶啟用物受體(uPA受體，uPAR)在人的胃腸道腫瘤包括胃癌、胰腺癌和結直腸癌都呈高表達。uPAR表達與結腸腫瘤形成的關係仍未徹底闡明。尿激酶型纖溶酶啟用物(uPA抑制物，PAI) 腫瘤中PAI-1的水平與預後呈負相關。
3、II型絲氨酸蛋白酶ST14/SNC19 為1993年從大腸癌減數雜交庫中篩選得到的，具有降解細胞外基質的能力，與轉移相關。並證實其作用底物為uPA及HGF/SF前體(BC-uPA及Pro-HGF/SF)，與腫瘤粘附、遷移、浸潤和血管生長有關。在大腸癌研究中，癌旁粘膜ST14/SNC19表達高者淋巴結轉移多。
應用Microarray技術，對比ST14轉染RKO細胞前後，發現26個轉移相關基因表達有差異。其中15個為促進轉移基因，11個抑制腫瘤細胞轉移。促進轉移的基因表達上調，如生長因子、細胞粘附素、轉移相關蛋白酶類、訊號轉導分子及癌基因等。
抑制轉移基因表達下調，如Maspin、TIMP2等。這些基因的變化均可能使細胞轉移能力增強。但其表達下調的基因中5個為促轉移基因，表達上調的基因中7個為抑制轉移基因，而有可能使轉移能力減弱。這些對轉移的影響尚需進一步研究證實。高表達ST14的細胞遷移能力、侵襲能力增加，促進ECM降解，共聚焦顯微鏡觀察發現能使骨架蛋白F-actin解聚去極化。經高通過基因晶片檢測，亦證實該類變化。
SNC19轉染表達後表達明顯上調的基因有：BRMS1、CSAP8、caveolin-1、CSF1、C-ETS2、ETV4、HPSE、IGF2、KISS1、MGAT5、、CSAP9、H-Ras、ICAM5、KAI1、MMP15、MMP16、MUC1、PIK3、PAI2、TGFA。
SNC19轉染表達後表達明顯下調的基因有：MMP3、MMP7、Maspin、BCSG1、Osteopontin、TIMP-2。
4、Maspin 為絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族中的一員，是Zou等在1994年通過正常乳腺上皮與乳腺癌進行減數雜交和差異顯示技術得到的。浙江大學腫瘤研究所應用mRNA差異顯示分析技術，發現maspin在胃癌，及賁門癌和大腸癌配對標本中表達增高。在應用基因晶片研究時，通過對21對大腸癌和正常黏膜組織配對標本的檢測，同樣發現16例大腸癌中maspin表達明顯升高。反義maspin轉染大腸癌COLO205細胞系，大腸癌細胞出現聚集增多，粘附增強，不規則形態增多的形態學變化。研究表明：Maspin基因與大腸癌轉移相關，但其作用的具體機制仍需進一步研究闡明，
5、其他蛋白酶和蛋白酶抑制物表達改變 組織蛋白酶D(cathepsin D)的表達影響癌腫細胞的浸潤性。分泌的組織蛋白酶主要源自基質細胞如成纖維細胞。在結直腸癌，組織蛋白酶D在惡性細胞中也有表達，但由於其表達的變異度很大，因此與預後的關係不明確。
(三)血管生長因子
對此有協同作用。這些因子還可通過自分泌必刺激和旁分泌刺激腫瘤細胞生長。各種血管生長因子的產生對腫瘤的快速增殖和浸潤生長顯然是十分重要的，因腫瘤生長必需有豐富的血供b)，它們可刺激血管內皮細胞增生和產生其它形成毛細血管的因子。b-FGF和TGF-b、a(TGF-b及a結直腸癌細胞可產生血管生長素(Angiogenin)[25]/鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)[25]、轉化生長因子
約100年前，發現無論是否由腫瘤細胞誘生，腫瘤內血供遠較周圍正常組織豐富。1971年Folkman提出腫瘤增長依賴於血液供應的觀點，缺乏血流、氧份及營養物質腫瘤將呈休止狀態，保持2-3mm3大小，進而凋亡[26]。血管生長因子有一系列家族成員，有瘤細胞表面存在血管生長因子相關的受體(VEGFR)。該跨膜受體結合配體VEGF即激活了酪氨酸激酶(TK)，進而導致血管內皮或/及淋巴管內皮的增生。
在VEGF家族成員中，VEGF A是血管增生的主要介質，與其相關的有VEGF B、C、D、E，並各有相關的VEGFR1、2、3及胎盤生長因子(PIGF)。VEGFR1與2位於血管內皮細胞樹突樣細胞及腫瘤細胞表面，VEGFR1在造血幹細胞表面也可有，VEGFR3位於淋巴管內皮細胞。
VEGF除促進內皮細胞增殖，可調節內皮細胞遊走，增加血管滲透性，調控免疫反應調節血管淋巴管增生。顯然血管內皮細胞涉及腫瘤的發展、浸潤與轉移。
(四)其它轉移相關分子
1、轉移抑制基因nm23 nm23是Steeg從轉移潛力不同的鼠黑色素 瘤細胞系中分離出來的。nm23基因可能通過絲氨酸磷酸化過程調節細胞增殖。其中nm23-H1亞型與腫瘤轉移的關係更為密切[27]。人同源基因nm23-HI也定位於染色體17q21上，而這一區帶在結直腸癌中經常發生雜合性丟失。在人結直腸癌中已觀nm23-H1基因LOH可能是大腸癌惡性進展的晚發事件，與大腸癌嚴重侵襲性行為緊密相關，並由此提示nm23-H1基因可能參與了人大腸癌惡性進展及轉移過程的調節[28]。然而隨著研究的深入，也有相反的結論[29]。
2、PRL3基因 Vogelstein及其同事們用基因表達系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE.)鑑定了一個在12個結腸癌肝轉移中都呈高表達的磷酸酶PRL-3(phosphatase of regenerating liver-3, 又稱PTP4A3Protein tyrosine phosphatase type IVA3)，而在其相匹配的同一個體的原發腫瘤中不表達。它屬於新一類異戊二烯化的磷酸酶[30]。
3、骨橋蛋白(OPN) OPN是一種分泌型糖基化磷蛋白，不僅與骨組織的礦化密切相關，還與Ca2+、NO等細胞信使、巨噬細胞趨化反應、平滑肌細胞增生、腫瘤的轉移及感染等多種生理、病理現象密切相關，被認為是一種新的細胞訊號分子[31]。有研究表明，OPN在大腸癌肝轉移組織中的表達較原發腫瘤明顯增高[32]，其配體-受體之間的相互作用在促進大腸癌肝轉移過程中可能發揮重要作用。丁凌等實驗證明腫瘤細胞表達Osteopontin者其同質粘附降低，易於分離自原腫瘤團塊脫落。而異質粘附能力增加，如血管內皮細胞間粘附增加，易於粘著於轉移部位。從免疫組化觀察，腫瘤組織及其周圍肝組織均顯陽性著色，可能於肝細胞存在其受體CD44及整合素有關。
4、細胞訊號轉導相關分子Rho蛋白：G蛋白中屬ras超家族(即小G蛋白)約有50多個成員，可以分為Ras、Rho和Rab三個主要的亞家族。Ras蛋白主要參與細胞的增殖和訊號轉導;Rab參與調節細胞內膜交通;Rho蛋白(與Ras有30％同源性)對細胞骨架網路的構成發揮調節作用，從而影響細胞形態[33]。研究表明在大腸癌肝轉移組織中能夠檢出Rho蛋白的過表達[34]。研究發現Ki-ras 第12密碼子的缺陷和大腸癌肝轉移潛能密切相關[35]。
雖然經過研究者的不懈努力，有更多的大腸癌肝轉移相關基因和相關的分子事件正被揭示。但腫瘤相關基因相互間存在紛繁的轉導、調控、抑制或啟用的關聯。Vogelstein等認為，數百個腫瘤相關基因相互聯結成小“節”(node)及其網路，節與節的聯通成為一組組的網路[45]。肝轉移的發生必定涉及多個基因和蛋白的相互協同或拮抗作用,有些研究結果的相互不一致也給研究工作造成了的困惑。
五、大腸癌肝轉移的分子生物學和生物資訊學研究
越來越多的科學家應用系統生物學的觀點，將基因組水平、轉錄水平和蛋白表達水平做為一個整體系統來研究，從更大、更深的層面上來理解整個生命系統。針對大腸癌肝轉移，浙江大學腫瘤研究所整合染色體拷貝數變化資料來分析不同表型間基因表達譜的差異，研究染色體上特定某一段包含的基因的表達情況，從整體瞭解、識別大腸癌肝轉移在染色體及基因組二個層次發生的分子事件，顯然比僅分析基因組資訊更為全面及有效。並進行了以下研究：
(1)對50例人類原發性結直腸癌的CGH分析中確定了7個染色體擴增區域和6個染色體缺失區域，其中16q的高頻率缺失未見相同報道。對16q20-21區段以生物資訊學方法分析，尋找到與肝轉移相關的基因，並進一步以生物技術方法逐一驗證，獲得了相對整體的資訊。
(2)應用AFFYMETRIX公司的HG-U95A晶片，對13例結直腸癌組織、12例結腸癌肝轉移組織進行全基因組表達譜分析，並以9例對應的正常結直腸粘膜組織作對照。在採用相同的篩選統計演算法和相同的分類方法時，整合染色體拷貝數變化資料與基因晶片資料可以使腫瘤分類準確率從36％大幅提高到95％，並獲得一組大腸癌肝轉移相關基因。
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