腦膠質起源的腫瘤是中樞神經系統的最常見腫瘤，也是人類難治性腫瘤，其中膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）最具代表性，因其不同腫瘤間以及同一腫瘤內部變化多樣和不均一性（heterogeniety）的組織形態學，又被冠以多形性膠質母細胞瘤的稱謂。近二十年來，隨著認識的不斷深入，GBM的不均一性已經不僅指其組織學表現形式，還指其不均一的生物學行為（增殖與凋亡、血管形成與侵襲遷移），更延伸到不均一性的治療反應[1,2]。縱貫於整個上世紀九十年代，GBM的不均一性僅歸因於腫瘤細胞的基因表型變化。腦腫瘤幹細胞的發現是神經腫瘤學研究的一個重要事件，深刻影響了我們對GBM的發生模式、腫瘤的不均一性、腫瘤細胞與微環境關係，以及治療策略的科學研究[1-3]。
一、腦腫瘤幹細胞鑑定與篩選
急性髓細胞白血病中僅約0.01％～1％的腫瘤細胞能夠通過實驗性移植誘匯出白血病，這是腫瘤幹細胞存在的首先證據[2]。隨後，乳腺、結腸、胰腺、肺等實體腫瘤中也發現了腫瘤幹細胞[4]。在高級別原發性腦腫瘤中，如膠質瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤、神經母細胞瘤，也發現腫瘤幹細胞；在低級別腦腫瘤中尚無肯定發現[5]。腦腫瘤幹細胞表現出和神經幹細胞類似的特點，如自我更新能力，無血清培養基中形成細胞球，表達幹細胞標誌和多譜系分化潛能；腦腫瘤幹細胞和神經幹細胞所不同的是其分化標誌異常表達、染色體異常且具有腫瘤形成能力[5]。如果說在腦腫瘤幹細胞研究領域什麼是最亟待確立和規範的，當屬腦腫瘤幹細胞的鑑定與篩選，關乎整個腦腫瘤幹細胞的理論體系。實際上，有關腦腫瘤幹細胞研究結果彼此不符甚至完全矛盾，腫瘤細胞亞群的分離和富集方法與步驟的不同是重要原因之一。
在GBM中最常使用的細胞表面分子標誌是CD133、A2B5、CD5、CD171、ITGA6和EGFR[3]。CD133、A2B5、CD15為尚未發現明確生物學功能的代用標誌，CD171、ITGA6和EGFR屬功能性標誌[3]。免疫磁珠分選和熒光啟用細胞分選（fluorescenceactivatingcellsorting，FACS）正是利用這些分子標誌進行腫瘤幹細胞的分離。
我們以CD133為例，說明利用腫瘤幹細胞代用標誌的方法學對解讀研究結果的影響。CD133最早用於造血幹細胞和神經幹細胞的分離，也廣泛用於腦腫瘤幹細胞的鑑定和分選[6,7]。在GBM中，CD133+細胞與CD133-細胞相比，在NOD-SCID鼠顱內種植，具有腫瘤發生能力[3]。但也有研究報告了不同的結果，無論從GBM組織標本還是體外培養的細胞系中，所分離的CD133-細胞也具有腫瘤形成能力[8,9]。這種不一致的結果可能由方法學缺陷造成。首先，同FACS法相比，免疫磁珠分選法缺乏特異性，分選所得的CD133+細胞中會混有和免疫磁珠非特異性結合的CD33-細胞，所富集的並非只是CD133+細胞[10]。類推，“CD133-細胞具有腫瘤形成能力”的結論，也可能是CD133-細胞在分選中混入了CD133+細胞[11]。當然，標準化的細胞純化判定方法和設計嚴格的內對照實驗有助於排除細胞的混淆因素。再者，膠質瘤基質中的內皮細胞表達CD133，從腫瘤組織中分離的CD133+細胞中會含有CD133+的內皮細胞，在移植模型中CD133+細胞的生長優勢則會超過CD133-細胞。但最近有研究報告，即使排除了內皮細胞的影響，FACS純化的CD133+細胞和CD133-細胞也都具有在裸鼠內促進腫瘤生長的能力[11]。用於腫瘤幹細胞分選的抗CD133抗體型別包括抗CD133/1和抗CD133/2二種抗體，分別識別CD133跨膜蛋白的二種不同糖基化表位，因而也會影響研究結果間的一致性[12]。方法學缺陷造成實驗結果的不一致同樣存在於A2B5、CD15等代用分子標誌[3]。
發現和優化既能夠作為腫瘤幹細胞富集標誌，又能作為治療靶點的功能性標誌是一個重要研究方向。我們以表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）為例做進一步說明。EGFR是神經幹細胞的標誌[13]，在調控腦室下區神經幹細胞的分裂和乾性維持方面具有相關作用[14,15]。分子神經病理學早已發現，EGFR在60％以上的原發性GBM中表達，而在繼發性GBM中不表達，具有一定的診斷和預後意義。在同一GBM腫瘤標本中，EGFR+腫瘤細胞的分佈是不均勻的，提示EGFR可以作為區別GBM中細胞亞群的分子標誌[16]。從人GBM組織標本和腫瘤幹細胞系中經FACS分離GBM細胞亞群，其中EGFR+細胞亞群無論是否與CD133和CD15共表達，都表現出最惡性的分子和功能表型[3]。通過功能獲得或丟失改變腫瘤幹細胞系細胞中EGFR表達，會相應出現促進或抑制細胞生長作用。顯然，EGFR表達是膠質瘤形成的必要條件，不僅可以作為膠質瘤細胞亞群的功能標誌，還可以作為GBM的治療靶點。研究還發現，EGFR-腫瘤細胞亞群在移植性腫瘤形成過程中可以出現EGFR的再表達，提示幹細胞標誌的表達調控是動態過程。新近又有研究證明，腫瘤細胞亞群的動態維持在黑色素瘤和GBM中確實是存在的[17,18]。
二、腦膠質瘤的腫瘤發生理論
複雜的腫瘤細胞構成是動態變化的，腫瘤細胞增殖、侵襲和專化中不斷需要進行細胞的重新補充，這一過程引起的腫瘤不均一性有兩種解釋機制，即：等級模式(hierarchicalmodel)和隨機模式（stochasticmodel）。
等級模式是指腫瘤發生和維持需要很少的一部分具有“乾性”的細胞亞群，也就是腫瘤幹細胞。腫瘤幹細胞自我更新失控而無限增殖和迷亂分化；由腫瘤幹細胞分化而來的多數腫瘤細胞不具自我更新的能力，而對腫瘤永生化無顯著作用。腫瘤的不均一性是因腫瘤幹細胞和其分化而來的後代細胞共存而造成。隨機模型是指腫瘤內多數細胞都有能力自我更新，對腫瘤的發生和維持均有作用。腫瘤的不均一性主要是因腫瘤細胞克隆之間分子遺傳及表觀遺傳不同而造成。更重要的是，隨機模型認為腫瘤內所有腫瘤細胞均具有腫瘤形成能力，儘管某種程度上，腫瘤形成過程也需要細胞團隊共同來維持；腫瘤內所補充細胞表型的不同，反應了腫瘤轉化和惡變不同階段所存在的細胞克隆[19,20]。
最初的多項研究證明，在造血系統惡性腫瘤、乳腺癌、結腸癌中，僅僅一小部分腫瘤細胞亞群具有形成新腫瘤的能力，是等級模式強有力的支援[21]。但陸續有研究質疑，等級模式是否適合於所有腫瘤型別。Kelly等2007年發現，從三種不同的原發性造血系統腫瘤小鼠模型中分離的細胞，超過10％具有在非照射接受鼠上誘匯出腫瘤的能力[22]。Shmelkov等2008年報告，在小鼠結腸癌中CD133-細胞也具有腫瘤形成能力[23]。與此呼應，單細胞移植分析發現人類黑色素瘤中腫瘤起始細胞超過25％。膠質母細胞瘤中最近也有類似報告。事實上，等級模式可能比較適合於造血系統腫瘤和若干實體腫瘤，如乳腺癌、結腸癌、胰腺癌以及髓母細胞瘤，這些腫瘤的起源組織中的細胞都有嚴格和明確的等級[11,18]。相反，GBM的起源組織具有間質樣的構築，如神經嵴和成熟腦，可能需要隨機模式和高度靈活的腫瘤發生模式。在GBM中，存在多組活躍的腫瘤起始細胞，每組都可以通過特異性的標誌蛋白表達和不同的功能表型或基因分子特點（侵襲、促血管形成、或增殖）來區分。腫瘤發生的隨機模式可能比等級模式更合適來解釋GBM的內在不均一性，但不能認為應該完全除外等級模式。最近在白血病研究中就提出，等級模式和隨機模式並不是互相排斥的，腫瘤細胞演變會同時受兩種模式管理[11]。
三、膠質瘤幹細胞的微環境
如果把腫瘤當作一個微生態系統來認識，不僅存在不同細胞克隆間的關係，還存在腫瘤細胞與微環境的關係。在這個協同作用系統中，腫瘤細胞克隆彼此間競爭性獲得氧氣、營養和空間，通過自然選擇致強者勝出；系統在腫瘤細胞和非腫瘤細胞之間創造的區域性微環境來促進腫瘤的生長、侵襲、細胞凋亡和/或治療抵抗以及免疫逃避。腦腫瘤的微環境成分包括小膠質細胞、巨噬細胞、星形細胞、少突細胞、神經元、膠質和神經元祖細胞、細胞外基質、周細胞和內皮細胞[1]。GBM細胞容易沿著有髓軸突、血管基底膜或室管膜下侵襲，說明了微環境對腫瘤細胞侵襲遷移的影響[24]。膠質瘤細胞和微環境中的內皮細胞相互作用，對維持腫瘤幹細胞的“乾性”狀態非常重要[25]。在異種原位移植模型中，內皮細胞或血管增殖可以使具有自我更新能力的細胞群擴增並加速腫瘤生長。相反，通過厄洛替尼（erlotinib）靶向抑制EGFR下調VEGF，或貝伐單抗直接中和VEGF，可以降低腫瘤生長和減少具有自我更新能力的細胞數目。
腫瘤幹細胞的維持和存活既有內在調控機制，即通過增殖和存活通路調控，包括c-Myc,Oct4(POU5F1)、Olig2和Bmi1[26]，又有發生在腫瘤所處微環境或小生境（niches）的外在調控機制，即通過生長因子及與細胞基質的相互作用調控。研究已經證明，腫瘤幹細胞和他們所處微環境之間的相互通訊，能夠影響GBM中的細胞命運[27,28]。但腫瘤細胞和微環境之間的相互作用還遠沒有弄清楚。在快速生長的膠質瘤中，我們仍然不清楚腫瘤細胞建立了自己的微環境，還是已存微環境來募集腫瘤幹細胞？腫瘤細胞和基質之間是怎樣的一種雙向作用關係？腫瘤幹細胞在腫瘤侵襲前緣的作用以及同免疫系統的相互作用如何？深入的研究腫瘤幹細胞和微環境之間的通訊機制，對於腫瘤幹細胞對腫瘤發生、生長、維持、侵襲和治療抵抗都有幫助，並藉以發現對惡性膠質瘤更有效的治療策略。
免疫缺陷鼠常用於腫瘤幹細胞的體內研究，但免疫缺陷鼠不能複製免疫系統成分，而這種成分存在於腫瘤病人並對細胞等級的形成具有重要驅動作用[5]。免疫缺陷狀態下可能會允許某些腫瘤細胞生長，也失真於病人體內的真實情況。基因工程修飾鼠模型可以產生同基因宿主，但相對缺少細胞的不均一性，而且不同種屬細胞間因子訊號的不同仍是腫瘤幹細胞研究的挑戰。應該說，目前尚沒有一個模型系統能夠完全代表人體條件下各種各樣的分子遺傳和表觀遺傳的變化，並忠實的反映腫瘤幹細胞和所處微環境之間的相互通訊特點。
四、對治療的提示
分子靶向治療與傳統的細胞毒性藥物相比，具有低毒和高效的特點，可以對現有治療方法進行互補，但惡性膠質瘤的第一代靶向治療試驗結果並不令人振奮。事實上，靶向藥物的單劑治療在複發性惡性膠質瘤中並不成功。顯然，腫瘤增殖細胞亞群的不均一性是影響臨床治療反應的重要原因之一[11,18]。例如，使用小分子的酪氨酸激酶（tyrosinekinase，TK）抑制劑來抑制EGFR激酶域可作為GBM的治療策略，但迄今僅有的幾項臨床研究報告均證明，單用EGFR抑制劑僅對GBM僅部分有效[29]，原因是在PTEN突變的腫瘤中，存在高水平的Akt依賴性訊號，以及在同一腫瘤細胞中存在多種TK的共啟用[30,31]。事實上，高度惡性的EGFR+GBM細胞對TK抑制劑確實有反應，選擇EGFR作為治療靶點是合理的，只是在同一腫瘤中EGFR+細胞和EGFR-細胞共存，而EGFR-細胞對治療的無反應導致腫瘤復發[11]。發展多靶向聯合抑制策略，同時靶向抑制多個分子和細胞，有望克服GBM部分細胞亞群對治療的抵抗[3]。
針對惡性膠質瘤的不均一性特點，進一步的治療策略應該考慮如下方面：
（1）繼續尋找能夠選擇性地識別GBM各細胞亞群的分子標誌，尤其是功能性的分子標誌，不僅可以作為潛在的治療靶點，還可預計治療反應和預後[32]。
（2）通過大宗臨床腫瘤標本的基因組和轉錄譜調查，把基因型和細胞譜系發生相結合用於惡性膠質瘤的分型，不僅可以促進理解腫瘤不同細胞亞群間功能的不同，還可以發現治療的新靶點[33]。
（3）用最少的基因標籤在GBM中識別腫瘤細胞亞群，前瞻性預計病人對特定靶向治療是否獲益，實現GBM的個體化和最優化治療[13,34-36]。
（4）GBM的有效治療策略應該把GBM“舞臺上的所有演員”都考慮在內，而且牢記GBM的不均一性應該認為是個動態的過程，具有特定分子標誌的GBM細胞亞群也具有時效性或視窗期，必須按照均衡考慮的治療策略和時間序貫採取治療手段[3]。
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