TLR9在胰腺癌中的表達及臨床意義
吳漢青朱世凱 張建軍 楊智勇 王春友 吳河水*
【摘要】目的 檢測TLR9在胰腺癌組織中的表達，探討其臨床意義。方法 採用實時定量PCR法、免疫印跡及免疫組織化學方法檢測30例胰腺癌組織及其相近癌旁組織、10例正常胰腺組織中TLR9的表達，並分析胰腺癌組織中TLR9的表達與病理分級、臨床分期及轉移的關係。結果 胰腺癌TLR9mRNA擴增倍數值為2.32(1. 41~3.22)，癌旁組織為1.23 (1.18~1.28)，兩組表達有顯著差異(t=2.642, P=0.023)。胰腺癌TLR9蛋白陽性表達率為73.3%，癌旁組織為33.3%，正常胰腺組織為20%，呈遞減趨勢(c2 =13.99, P=0.001)。胰腺癌TLR9高表達和腫瘤分化成度、TNM分期、淋巴結轉移呈正相關。Western blot結果與免疫組織化學一致，灰度分析結果顯示差異顯著。 結論 TLR9在胰腺癌組織中高表達,且TLR9表達與腫瘤分級有關 ,提示可能通過免疫機制參與胰腺癌的發生、發展過程。武漢協和醫院急診科吳漢青
【關鍵詞】胰腺腫瘤，癌，TLR9
TLR9 expression in pancreatic cancer and its clinic significance
Han-Qing Wu, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Zhi-Yong Yang, Chun-You Wang, He-Shui Wu
Department of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,China
Correspondence to: Professor He-Shui Wu, Email:[email protected].
[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer, and to explore their clinical significance. Methods: The real-time RT-PCR technique, western blot method and immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 in the pancreatic cancer, tissues near tumor, and normal pancreatic tissues which obtained during operation from 30 pancreatic carcinoma patients and 10 normal non-lump patient. The relationships with pathological grade, clinical stage, and metastasis of pancreatic cancer were statistically analyzed. Results
The amplification value level of TLR9mRNA expression in human pancreatic tissues, paracancerous tissues were 2.32（1.41~3.22）and 1.23（1.18~1.28），respectively（t=2.642,p=0.023）.The percentage of positive cells expressed TLR9 protein in human pancreatic tissues, paracancerous tissues and normal tissues were 73.3%, 33.3% and 20.0%,the protein expression level of TLR9 was gradually descending(c2=13.99,P=0.001). The highly expressed TLR9 correlated significantly with the degree of tumor differentiation、an advanced TNM stage and lymph node metastasis. Similar result was obtained by Western blot.Conclusions: TLR9 has a higher expression in pancreatic cancer tissues. TLR9 expression has a close relationship with pathological grades of pancreatic cancer, suggesting that TLR9 play an important role in the development and progression of pancreatic cancer through immunologic mechanism.
[Key Words] Pancreatic neoplasms; Cancer; Toll-like receptor 9
Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一新發現的古老的受體家族，不僅是參與天然免疫的重要受體，而且與特異性免疫、免疫耐受和某些疾病防治密切相關。近來發現toll樣受體可能參與多種惡性腫瘤的發生、發展過程[1]。而TLR9為該家族重要成員，能夠刺激B細胞和樹突狀細胞分泌大量的細胞因子和趨化因子，如白介素(IL)-12、IL-6、干擾素-γ、單核細胞抑制蛋白和金屬基質蛋白酶的表達[2]。很多腫瘤都出現TLR9高表達現象，但TLR9是否與胰腺癌的發生，發展有關，目前尚不清楚。本研究旨在通過觀察胰腺癌中TLR9的表達情況，探討其與胰腺癌發生發展的關係，並探討其臨床意義，以期為胰腺癌的治療提供新的依據。
資料與方法
一 、臨床病理學資料
30例人新鮮胰腺癌組織及相應的癌旁組織（據腫瘤邊緣1-2cm）取自胰腺癌患者、10例正常胰腺組織標本取自其他原因需行胰腺部分切除的非腫瘤患者，所有標本均為華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科中心2008年12月至2009年8月接受手術治療的胰腺癌患者且經術後病理證實，術前未行放療及化療。標本均在手術切除後立即採集，一式兩份，一份立即放入液氮中，然後置於-80℃儲存備用。另一份用10%甲醛固定後用石蠟包埋，用以免疫組織化學分析。40例患者中男性19例，女性11例，年齡39～75歲，平均年齡57歲。腫瘤組織病理分級：高分化12例，中低分化18例。 淋巴結轉移10例，未轉移20例。
二、實時定量PCR檢測TLR9基因表達情況
參照Trizol試劑盒(sigma公司)說明書提取組織總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度，然後用ReverTra Ace（Toyobo公司）逆轉錄合成cDNA。引物設計根據GenBank人TLR9mRNA序列，TLR9引物序列上游為：5´-GCCCAAATCCCTCATATCCC-3´，下游為：5´-AACAGTTGCCGTCCATGAATAG-3´,擴增產物為113bp。內參照物β-actin的引物，上游為：5´-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3´，下游為：5´-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3´，擴增產物為190bp（上海生工技術服務有限公司）。採用實時定量 PCR（SYBR GREEN）法檢測TLR9mRNA。擴增曲線反應程式：50℃ 2min，95℃ 2min，然後95℃變性15s，退火15s，延伸72℃ 45s，共40個迴圈。後72℃延伸10min終止反應。PCR儀為HONGSHI公司的SLAN Real-time PCR Detection System。胰腺癌或相應的癌旁組織以及10例正常胰腺組織的△CT=CT(目的基因)-Ct(β-actin), △△CT=△CT實驗-△CT對照, 我們以10例正常胰腺組織的△CT均值作為對照，通過計算得到擴增倍數=2-△△CT。三、免疫印記檢測TLR9蛋白表達情況
常規方法進行組織蛋白提取，考馬斯亮藍法測蛋白濃度。取15μl蛋白進行10％聚丙烯醯胺凝膠電泳，電轉至硝酸纖維素膜，5％脫脂奶粉封閉非特異性抗原，加入1：750稀釋的兔抗人TLR9單克隆抗體(cell signaling公司)，4℃孵育過夜，用含0.1％Tween20的TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，洗膜後加入增強化學發光底物EcL Plus試劑，曝光於x膠片上，曝光時間為30 s，常規顯影，定影。採用自動電泳凝膠成像分析軟體(Band scan v5.0)進行影象掃描和分析。
四、免疫組織化學檢測TLR9蛋白表達情況
採用免疫組織化學SP(streptavidin-perosidase)法，參照免疫組織化學試劑盒(武漢博士德公司)說明書進行。以已知TLR9陽性的肺癌組織[3]切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察細胞染成棕黃色者為陽性，著色物質呈顆粒狀或片狀，主要存在於腫瘤細胞胞漿內。染色結果通過雙盲評價，隨機觀察10個高倍視野，避開腫瘤邊緣及壞死區域，根據顯色強度和著色百分數進行半定量分析，依細胞陽性著色程度分為：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分。依著色陽性百分比分為：未染色為0分，陽性細胞總數<25%為1分，陽性細胞在25%-49%為2分，陽性細胞總數在50%以上為3分。將兩個分值相加，0～1分為陰性（C），2～3分弱陽性（），4～5分為陽性（），5分以上為強陽性（）。（）與（）為高表達，（C）與（）為低表達。
五、統計學方法
採用 SPSS 13.0 統計分析軟體，應用t檢驗、χ2檢驗、 Fisher 精確概率法及秩和檢驗作數值間的差異和相關性分析。以α=0. 05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學差異。
結 果
1 實時定量PCR結果
正常胰腺組織、胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中均有TLR9mRNA和β-actin mRNA的表達。以正常胰腺組織中TLR9mRNA作為對照，胰腺癌TLR9mRNA的擴增倍數值為2.32（1.41~3.22）,癌旁組織為1.23（1.18~1.28），兩組表達差異顯著（t=2.642，p=0.023）。
2免疫印跡結果
由圖1可見，癌及癌旁組織以及正常胰腺組織內均有內參GAPDH蛋白的表達，蛋白條帶位置為36 kDa，TLR-9的表達位置在130 kDa。TLR9在癌組織中的表達量明顯高於相應的癌旁組織及胰腺正常組織。
圖1 TLR-9蛋白質免疫印跡結果（1：正常胰腺，2：癌旁胰腺組織，3胰腺癌組織）
3免疫組化結果
TLR9蛋白主要表達於癌細胞的胞漿內，呈棕黃色或棕褐色，染色均一；癌旁組織及正常胰腺組織的胞漿中也可見到TLR9蛋白表達，但呈淺黃色且較胰腺癌組織少(圖2)。TLR9在正常胰腺組織、胰腺癌旁組織和胰腺癌組織中的陽性表達率分別為20％(2/10)、33.3％(10/30)和73.3％(22/30)，各組之間差異有顯著性統計學意義(χ2=13.99，P=0.001)（表1）。正常胰腺組織中TLR9未見高表達，而胰腺癌組織中TLR9蛋白高表達佔73.3％(22/30)。從正常組織、癌旁組織到胰腺癌組織，TLR9的陽性表達率呈遞增趨勢。30例胰腺癌癌組織中TLR9蛋白的高表達與腫瘤的部位以及腫瘤大小無關(P>0.05)，而與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05，表2)。
圖2 TLR9蛋白在胰腺癌組織、癌旁胰腺組織及正常胰腺組織中的表達（×200）；胰腺癌組織（A），癌旁胰腺組織（B），正常胰腺組織（C）
表1 TLR9蛋白正常、癌旁和胰腺癌組織中的表達情況
組別
例數
TLR9蛋白陽性
陽性率（%）
陽性
陰性
正常組織
癌旁組織
胰腺癌組織
10
30
30
2
20
22
8
10
8
20.0
33.3
73.3
表2 胰腺癌組織中TLR9高表達與病理引數的關係
臨床特徵
例數
TLR9高表達陽性
TLR9高表達陰性
陽性率（%）
P值
腫瘤部位
胰頭部
胰體尾部
20
10
15
7
5
3
75.0%
70.0%
1.00
腫瘤大小
≤3cm
>3cm
17
13
13
9
4
4
76.5%
69.2%
0.68
分化程度
高分化
中低分化
12
18
6
16
6
2
50.0%
88.9%
0.034
TNM分期
І CП
Ш-
13
16
7
15
6
1
53.8%
93.8%
0.026
淋巴結轉移
無
有
20
10
13
9
7
1
65.0%
90.0%
0.024
注：應用χ2檢驗、Fisher精確概率法進行統計學分析
討 論
TLRs是新近發現的病原模式識別受體，能夠識別特定型別微生物的保守分子成分，即病原體相關分子模式(pathogen―associated molecular patterns，PAMPs)。1997年Medzhitov[4]等首次發現了人類的第一種Toll同源變體(即TLR4)，後又發現並確認了10種人的TLR家族蛋白，分別被命名為TLR1-TLR11。其中TLR9是TLR家族的重要成員，其特異性識別的PAMPS為細菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脫氧核苷酸(CpG―oligodeoxynucleotides，CpG-ODN)[5]，TLR9在介導外源CpG DNA啟用先天免疫過程中有重要的生物學意義。TLR9除了抗感染作用,還與自身免疫紊亂、惡性腫瘤的發生相關[6]。有研究表明，由TLRs包括TLR9誘導的訊號通路可能在腫瘤形成過程中起著重要作用，TLRs表達的上調與胃癌、腸癌、肺癌等發生、發展可能有密切關係[7]。同時研究還發現TLR9在腫瘤上的表達可為腫瘤的化療、免疫治療提供新方法。但目前對於TLR9在胰腺癌中的表達及作用瞭解甚少。
本研究對胰腺癌腫瘤組織內的TLR9在基因水平和蛋白水平以及TLR9蛋白大小都作了檢測，並和癌旁胰腺組織及正常胰腺組織進行對比，在基因水平上結果發現胰腺癌組織、癌旁胰腺組織及正常組織中均有TLR9mRNA的表達，但癌組織的表達最高，顯著高於非癌組織(P<0.05)。在免疫組化染色圖片上，發現TLR9主要在胰腺癌的胞漿細胞中表達，並且胰腺癌組織中TLR9陽性表達率明顯高於胰腺癌旁組織和正常胰腺組織，這與Droemann[3]在肺癌中的研究呈正相關結果一致。胰腺癌組織中TLR9的高表達與患者的年齡、性別、腫瘤的部位以及大小無關，而與腫瘤分化程度、TMN分期、淋巴結轉移或遠距轉移有關，提示TLR9受體不僅參與正常胰腺組織的生長和發育等生理功能，也參與胰腺組織的惡性轉化過程。Schmausser[8]等的研究證實TLR9與其他TLRs共同參與胃癌的發生。本研究結果與其一致。
近年大量研究證實，CpG ODN具有很強的Th1方向的免疫凋節作用，主要是通過與TLR9結合，誘導分泌IFN-7、IL-12等Th1極性的細胞因子，促進Th0細胞向Th1方向分化。如CpG DNA通過序列非依賴性受體介導的內吞作用進入樹突細胞，在溶酶體區域與TLR9特異性作用，然後通過IRAK1、IRF7、TRAF6、MAPK、核因子-KB(NF-KB)途徑及銜接子MyD88啟用下游訊號通路[9]。通過下游訊號通路最終導致類漿細胞樹突細胞的活化併成熟為專職抗原提呈細胞。這些成熟的抗原提呈細胞表面表達共刺激分子(CD80、CD86)、趨化因子受體CCR7，分泌Th1型細胞因子，活化NK細胞[10]，由於中性粒細胞表面Fc受體表達的增加，細胞毒活性增強，從而進一步引起更多類漿細胞、樹突細胞活化成熟、抗原提呈。通過CpG與TLR9的作用，抗原提呈細胞如Dc細胞可以交叉提呈外源性抗原，從而交叉啟用CD8+T細胞、NK細胞、巨噬細胞的活化，產生Th1型的免疫反應，啟用天然免疫反應[11]。而目前CpG ODN作為免疫佐劑通過TLR-9誘導強的Thl型免疫應答在人肺腺癌A549細胞上，可能作為單一治療或者免疫治療的輔助治療應用於腫瘤的治療[12]。
綜上所述，TLR9在胰腺癌組織中的高表達提示其有可能成為腫瘤治療的一個新的干預靶點。TLR9蛋白的表達與胰腺癌細胞的惡性程度有關，亦與胰腺癌是否有淋巴結轉移有關，這為胰腺癌的治療及預後判斷提供了參考依據。運用 TLR9的相關配體CpG ODN對胰腺癌進行免疫治療可能為胰腺癌治療提供了新的治療可能。
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本文發表在《中華胰腺病雜誌》2011年第三期，請檢視原文
本課題受國家自然科學基金資助（基金編號：30200272）
作者簡介：吳漢青，男， 在讀博士，主要從事胰腺腫瘤方面的研究。E-mail:[email protected]
通訊作者：吳河水，教授，博士生導師，武漢 430022，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科中心；Email:[email protected].
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