一、核苷(酸)類似物耐藥的病毒學基礎
HBV侵入人體後，與靶細胞膜上的受體結合，脫去包膜，進入細胞質中，脫去核衣殼，部分雙鏈環狀HBVDNA進入靶細胞核中，在DNA聚合酶作用下，以負鏈DNA為模板，延長正鏈，修補裂隙區，形成共價閉合環狀DNA(cccDNA)。HBVDNA的複製首先以cccDNA為模板，在宿主RNA聚合酶的作用下，轉錄成3、5kb、2、4kb、2、1kb和0、7kb等。
HBV每24h可複製1012～1013拷貝。HBV雖然屬於DNA病毒，但其複製過程並非DNA-DNA的直接複製過程，而是經過前基因組RNA的中間過程，即DNA-RNA-DNA的複製過程。在前基因組RNA逆轉錄為負鏈DNA的過程中，HBV逆轉錄酶由於缺乏嚴格的校正機制，導致HBV複製過程中核苷酸錯配率較高，介於其他DNA病毒和RNA病毒之間，大約為1/105。HBV複製的這種過程和特點，決定了同一患者體內不同的HBV株基因序列之間也存在差別，因此，每一個患者體內的病毒都是由存在基因序列差異的病毒株組成的動態變化的病毒群，即HBV以準種的形式存在。
HBV病毒群的演變也符合達爾文進化論的規律。有些位點的變異，可能是致死性的，發生這種變異的HBV不能存活。有些位點的變異對其複製能力沒有顯著影響，但很多位點變異導致子代病毒複製能力降低或增強。不同基因序列的病毒株在病毒群中所佔的相對比例，一方面取決於病毒株自身的複製能力，另一方面也受到機體免疫系統或藥物的選擇壓力的影響。
核苷(酸)類似物的作用機制：其進入機體後，形成三磷酸活性成分，與機體天然的脫氧三磷酸核苷競爭性結合到HBV聚合酶上。但由於三磷酸化的核苷(酸)類似物不具備天然的dNTP的結構，而使HBV的DNA鏈合成終止，這是核苷(酸)類似物抑制HBV複製的機制。但如果患者體內的HBV序列發生變異，導致產生的HBV聚合酶與核苷(酸)類似物結合力降低，那麼變異的HBV即不受核苷(酸)類似物的抑制或抑制能力下降。因此，在繼續應用核苷類似物治療的情況下，野生株病毒因對核苷(酸)類似物敏感而繼續被抑制;變異株病毒因具備一定的複製能力，而且對核苷(酸)類似物不敏感而逐漸替代野生株，成為體內HBV的優勢株，從而導致患者對於核苷(酸)類似物的耐藥。
二、核苷(酸)類似物耐藥變異相關概念及命名方法
(一)耐藥變異相關概念
常用的HBV耐藥變異相關術語或概念有：
1、原發性無應答：指核苷(酸)類似物治療12周，HBVDNA載量的下降幅度小於1log10IU/ml。原發性治療失敗可能與宿主、藥物或病毒等因素相關：患者依從性差、藥物吸收障礙、藥物在體內轉換成活性成份能力差;藥物的抗病毒效力弱或治療劑量太小;HBV發生耐藥變異等均可造成原發性治療失敗。
2、病毒學突破：指在治療過程中，相隔1個月的連續兩次檢查，血清HBVDNA載量比獲得應答後的最低值的上升值均大於1log10，病毒學突破在治療依從性良好的患者常常提示耐藥的產生。
3、病毒反彈：指患者治療後獲得病毒學應答，雖繼續治療，HBVDNA載量升高≥20000IU/ml或高於治療前水平。
4、生化學突破：指治療達到血清ALT復常後，在繼續治療的過程中，ALT水平升高並超過正常值上限。當ALT水平上升大於5倍正常值上限則稱為肝炎突發。
5、原發性耐藥變異：指藥物作用靶位的基因及其編碼的氨基酸發生變異，導致變異病毒株對治療藥物的敏感性下降。如rtM204V/I的變異病毒株對LAM的敏感性顯著下降。雖然原發性耐藥變異株對藥物的抵抗性增加，但也常導致變異病毒本身的複製能力下降。
6、繼發性耐藥變異：指由於原發性耐藥變異病毒株複製能力下降，在原發性耐藥變異的基礎上，病毒株也可在其他位點發生變異，這些變異可部分恢復變異病毒的複製能力或可導致變異病毒對藥物敏感性的進一步下降。如在LAM的耐藥變異中，rtM204V/I為原發性耐藥變異，常常伴隨的rtL180M變異為補償性耐藥變異。
7、基因型耐藥：指檢測到已在體外的表型分析研究中被證實與抗病毒藥物耐藥相關的HBV變異。
8、表型耐藥：通過體外複製系統證實檢測到的HBV變異會降低其對抗病毒藥物的敏感性。當抑制病毒複製所需的EC50與野生株相比增加100倍以上稱為高度耐藥、10～99倍為中度耐藥、2～9倍為輕度耐藥。
9、交叉耐藥：對一種核苷(酸)類似物耐藥的HBV變異對其他一種或多種核苷(酸)類似物也具有耐藥性。如LAM治療發生在rtM204I的耐藥變異株，對LdT也具有耐藥性。
10、多藥物耐藥：指當不同作用靶位的藥物進行序貫或同時治療，HBV可在不同藥物的靶位發生耐藥變異，產生對多種藥物耐藥的變異病毒株。如LAM治療後，病毒變異發生在rtM204V/I和rtA181T/V，則該病毒株對LAM和ADV均耐藥。
基因變異是導致病毒耐藥的基礎。在臨床中首先出現基因變異，然後出現病毒學突破和病毒反彈，再出現生化學突破。對臨床病毒耐藥檢測結果的解釋，需要結合病毒載量的變化、檢測試劑和方法及臨床表現來綜合分析。
(二)耐藥的命名方法和書寫格式
HBV聚合酶可分為4個不同的功能區：末端蛋白、間隔區、逆轉錄酶區。已知的耐藥變異均位於逆轉錄酶區內。8種基因型HBV的逆轉錄酶均由334個氨基酸殘基組成，因此目前國際通用的HBV耐藥變異從rt第1位氨基酸殘基作為起始，書寫格式為“rt-野生型氨基酸縮寫-相對於逆轉錄酶區起點的氨基酸變異位點-變異後的氨基酸縮寫”，如rtM204V表示逆轉錄酶區的第204位由蛋氨酸(M)變異為纈氨酸(V)。當在同一位點出現2種以上的氨基酸改變即混合HBV病毒群時，應同時將兩種氨基酸改變列出。
三、核苷(酸)類似物常見耐藥變異位點與變異發生率
1、與拉米夫定耐藥相關的變異：現有研究表明，LAM常見耐藥相關變異為rtM204I/V±rtL180M變異，其中rtM204V多與rtL180M變異聯合出現，rtM204I變異可單獨出現。根據已公佈的LAM治療核苷(酸)類似物初治患者的關鍵性臨床試驗(pivotaltrials)資料計算的1～5年累積耐藥發生率分別為24％、38％、49％、67％與70％。
2、與阿德福韋酯耐藥相關的變異：現有研究表明，ADV常見耐藥相關變異為rtN236T與rtA181V/T變異，兩個位點變異可單獨或聯合出現。根據已公佈ADV治療核苷(酸)類似物初治患者的關鍵性臨床試驗資料計算的HBeAg陰性患者1～5年累積耐藥發生率分別為0％、3％、11％、18％與29％。
3、與恩替卡韋耐藥相關的變異：目前研究結果顯示，ETV耐藥相關變異是在rtM204V+rtL180M變異基礎上，再聯合rtT184、rtS202或rtM250三個位點中至少一個位點的氨基酸替代變異。根據已公佈ETV治療核苷(酸)類似物初治患者的關鍵性臨床試驗資料計算的1～5年累積耐藥。
4、與替比夫定耐藥相關的變異：目前研究結果顯示，LdT常見耐藥相關變異為rtM204I。其他位點如rtA181V/T等尚存在爭議。根據已公佈LdT治療核苷(酸)類似物初治患者的關鍵性臨床試驗資料計算的第1與第2年累積耐藥發生率分別為4％與22％。
需要說明的是，以上各種藥物所涉及的慢性乙型肝炎的人群和設計均有所不同。
四、乙型肝炎病毒耐藥變異的檢測與分析
(一)常用基因型耐藥檢測技術
1、PCR產物直接測序：是將HBV基因組的逆轉錄酶區進行擴增後直接進行測序分析的方法。PCR產物直接測序法可檢測已知和可能的未知耐藥變異位點，是最常用的基因型耐藥檢測方法之一。Keefffe等認為PCR產物直接測序的方法應作為基因型耐藥檢測的金標準。該方法的缺點是靈敏性較差，只有當變異株超過HBV準種池的20％時才能被發現。
2、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多型性：該方法具有較強的靈敏性，可檢測數量佔HBV準種池5％的耐藥變異株，曾被國內外眾多實驗室應用於LAM耐藥變異檢測工作中，近來國內也建立了基於該技術的ADV耐藥變異檢測方法。然而PCR-RFLP只能檢測已知、單位點的變異，對於少數耐藥變異位點監測不失為一種簡便、快速且廉價的方法。但隨著多種核苷(酸)類似物的相繼問世和HBV耐藥變異位點的不斷出現，該方法將難以勝任多位點變異的檢測。
3、反向雜交法：基於該技術的INNO-LiPA方法在國外已獲准應用於臨床檢測，目前可檢測包括LAM、ADV、ETV與LdT常見位點耐藥位點。該法可檢測變異株佔HBV準種池5％～10％的樣品，故敏感性較好，但其同樣只能檢測已知位點變異，另外該檢測價格昂貴，國內尚難廣泛應用於臨床檢測。
4、實時PCR：該方法操作簡便，可檢測變異發生率低於10％的耐藥變異。缺點為僅能檢測已知位點;同時，針對每個位點的不同變異均需合成相應的探針，隨著核苷(酸)類似物耐藥位點的增多，相應合成探針的費用增高。國內已有經SFDA批准的實時PCR試劑盒用於rtM204V/I變異的臨床檢測。
5、基因晶片：亦稱DNA晶片、DNA微陣，具有快速、高效、敏感、平行化和自動化等優點，可檢測已知變異位點。另外隨著基因晶片高通量測序技術進展，還可用於檢測未知變異位點。目前國內用於核苷(酸)類似物耐藥臨床檢測的晶片正在研發中。
6、限制性片段質譜多型性技術：該技術是將PCR-RFLP技術與基質輔助鐳射解吸電離飛行時間質譜技術結合，靈敏度高，能夠發現數量不足HBV準種池1％的變異株，但其同樣僅能檢測已知位點變異，且價格昂貴，很難在臨床推廣應用。
(二)體外表型分析
體外表型分析是確認基因型耐藥的“金標準”，常用半數有效濃度來評價耐藥程度的高低。其原理是將含有待檢測耐藥變異位點的HBV全基因組匯入肝細胞來源的細胞系，再將不同濃度梯度的核苷(酸)類似物加入細胞培養液中，經過一定培養時間後檢測藥物作用下HBVDNA的複製情況，計算EC50，通過與野生株病毒的EC50比較，判斷該變異對核苷(酸)類似物的敏感性。
(三)虛擬表型分析
進行虛擬表型分析的前提是建立包含相互關聯的臨床資料、基因型和表型耐藥資訊的HBV耐藥變異資料庫。當向資料庫提交一待分析序列時，資料庫會查詢與該序列最匹配的HBV序列，根據其匹配序列的臨床以及耐藥檢測情況來推斷待分析序列耐藥變異情況。作為研究表型耐藥的一個輔助手段，虛擬表型分析雖不能取代體外表型試驗，但將有助於已知耐藥變異的監測和新變異的發現。目前，可利用的資料庫包括澳大利亞的。
五、乙型肝炎病毒耐藥變異的臨床處理
(一)乙型肝炎病毒耐藥變異的預測因素
多種因素可能與HBV對核苷(酸)類似物耐藥發生機率相關，包括應用核苷(酸)類似物種類、初始治療時HBVDNA載量、有肝纖維化/肝硬化基礎、曾接受過核苷(酸)類似物抗病毒治療等。此外，男性患者、體重指數高及酗酒等也是抗病毒治療中易發生耐藥變異的高危因素。但是越來越多的研究提示早期病毒學應答情況是預測耐藥發生率的重要指標。
(二)乙型肝炎病毒耐藥變異的預防策略
1、合理選擇核苷(酸)類似物抗病毒治療的適應證：對免疫耐受期或非活動期HBV感染者，尤其是年齡較輕者，如不需要接受免疫抑制劑或化療藥物治療，則不建議應用核苷(酸)類似物。對於初次出現活動的慢性HBV感染者，特別是年齡較輕者，應充分分析其誘發因素而慎重決定應用核苷(酸)類似物。
2、合理選擇抗病毒治療方案：治療方案建議參考中國《慢性乙型肝炎防治指南》。對有抗病毒治療適應證的患者，若選用核苷(酸)類似物，儘量選用抗病毒作用強、耐藥變異發生率低的藥物;同時，一定要了解既往抗病毒治療情況，包括核苷(酸)類似物應用情況、治療應答情況及耐藥變異情況，以便選擇無交叉耐藥的藥物治療。此外,應儘量避免單藥序貫治療，以免多藥物耐藥的發生。
3、提高患者的依從性：在用核苷(酸)類似物進行抗病毒治療期間，要反覆強調遵醫囑按時、足量服藥。對臨床試驗資料分析表明，超過30％的病毒學突破是由患者依從性差造成。在任何情況下，逐步減量的用藥方案都是錯誤的，將顯著提高耐藥風險。
4、規範監測HBVDNA與基因型耐藥，及時調整治療方案：HBVDNA載量是應用核苷(酸)類似物抗病毒治療過程中耐藥監測的最重要指標。治療期間應定期檢測HBVDNA水平。大量臨床試驗資料表明，早期病毒學應答情況是預測耐藥發生率的重要指標，因此APASL與EASL指南均建議根據早期病毒學應答情況來調整治療方案，以提高療效，降低耐藥發生率。
現有指南均未推薦將基因型耐藥檢測作為核苷(酸)類似物抗病毒治療常規檢測對於核苷(酸)類似物治療過程中出現病毒學突破的患者應進行基因型耐藥檢測;除非有明確證據表明初治患者感染HBV來自於接受核苷(酸)類似物抗病毒治療患者。一般不主張對患者在初治治療時進行基因型耐藥檢測。
(三)已發生耐藥變異的臨床處理建議
對少數治療前ALT正常、肝組織學檢查炎症或纖維化病變輕微。
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