動脈硬化及微血管病變基礎上引發的心血管疾病(CVD)是糖尿病的主要併發症，是糖尿病致殘致死的主要原因。血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)受損及功能失調，是導致糖尿病血管併發症發生與發展的始動因素。因此，研究內皮損傷的機制，尋找修復損傷血管內皮結構和功能的有效途徑成為目前的研究熱點。
內皮祖細胞(EPCs)是一種來源於骨髓、能在體外擴增並進一步分化為ECs而參與受損血管內皮的修復與血管新生，不管是動物實驗還是臨床研究均證實新生血管中25％的ECs是由EPCS分化而來的，所以，EPCs被認為是對各種心血管疾病和損傷血管進行治療的重要生化因子。內皮型一氧化氮合酶(eNOS)是保證EPCs遷移能力的重要物質。
在體內高糖環境下可引發氧化應激的出現，而氧化應激又可以導致EPCs功能受損及一氧化氮(NO)產生減少，而應用超氧化物歧化酶(SOD)干預EPCs後可使其分泌NO增加，功能恢復。抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，非酶抗氧化系統, 包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽、褪黑素、α-硫辛酸(ALA)、類胡蘿蔔素、微量元素銅、鋅、硒(Se)等。
本研究應用高濃度葡萄糖孵育EPCs，誘發氧化應激，測定培養上清的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平，同時用實時熒光定量RTPCR觀察GPx-1和eNOS的mRNA表達,用western blot測定GPx-1和eNOS的蛋白表達，然後應用抗氧化劑ALA進行干預，來探討葡萄糖引發EPCs損傷的機制及治療措施，為糖尿病血管併發症的預防及治療提供依據。
1 、材料與方法
1.1 材料
1.1.1實驗動物：清潔級健康雄性Wistar大鼠(體重180-200 g)15只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證編號：902035。
1.1.2 試劑 MDA及NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，50％葡萄糖注射液(華瑞製藥有限公司)，EGM-2MV培養基(美國LONZA公司)，大鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋有限公司);
人纖維連線蛋白(索萊寶科技有限公司)，胰酶(美國sigma公司)，RNA提取試劑Trizol Reagent(美國Invitrogen)，逆轉錄酶(M-MLV )、隨機引物均為美國Promega生產，兔抗人多克隆GPx-1抗體(英國ABCAM公司)，兔抗人多克隆eNOS抗體(美國Santa公司)，ALA(日本衛才製藥有限公司)。
1.1.3 實驗儀器 紫外分光光度計(756MC)(上海精密儀器科學有限公司
)，ABI 7300 實時熒光定量 PCR 系統(美國PE公司)，UVP凝膠掃描系統(美國UVP 公司)，DYZ22A型雙恆定時電泳儀及DYY-Ⅲ橋式電泳儀(北京市六一儀器廠)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)超淨臺(HFsafe1200)(力康發展有限公司)，二氧化碳培養箱(MCO-15AC)(德國Heraeus公司)，細胞培養板及培養瓶(美國Corning公司)
1.2 實驗方法
1.2.1大鼠骨髓EPCs培養
用手術剪將處死大鼠的下肢取下，剪去下肢的面板，將下肢置於75％酒精浸泡30min，於超淨臺中沿膝關節將股骨與脛骨分開，剔除盡大鼠下肢的肌肉，無菌的條件下暴露下肢骨，浸泡在含有PBS的培養皿中，將大鼠下肢骨從兩端截斷，於超淨臺中用PBS反覆沖洗骨髓腔;
然後將沖洗液緩慢疊加於大鼠淋巴細胞分離液上， 2000轉/ min，離心20min，離心後管內液體分為三層，吸出中間白色雲霧層，加入4倍體積的PBS混勻，1000轉/ min，離心10min，棄去上清液後，再重複洗滌1次。末次離心後，棄上清，加入EGM-2MV重懸細胞。
Fn按照5ug/cm2，鋪被到孔板裡，將細胞懸液接種到六孔板及24孔板中，接種密度為2×106個/mL。48小時後首次全量換液，以後每天換液，7天后隔天換液。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。
1.2.2EPCs的鑑定
形態學鑑定：每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。
EPCs攝取DIL-Ac-LDL，結合FITC-Lectin-UEA-1的實驗：將培養第10天的細胞，加入含DIL-Ac-LDL(2.5ug/mL)培養基，孵育4h，用PBS洗滌3次，2％多聚甲醛固定20min，再加入FITC-Lectin-UEA-1(10ug/mL)，孵育1h，鐳射共聚焦顯微鏡下觀察，雙染為橙黃色的細胞為EPCs，計數雙染細胞。
1.2.3實驗分組
用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化培養4天的EPCs，分組貼壁24 h後分別
給予葡萄糖5 mmol/L作為正常對照組(NC)、30 mmol/l葡萄糖作為高糖組(HS),葡萄糖(30 mmol/l) +α硫辛酸(40µg/l)作為ALA組，孵育EPCs 48小時，檢測各項指標。
1.2.4 NO及MDA測定採用化學比色法，Western blot法測定EPCs GPx-1及eNOS表達，實時熒光定量RT-PCR法測EPCs GPx-1 mRNA的表達
1.3 統計學方法
所有資料採用SPSS 13.0統計分析軟體包進行分析。所有計量資料用均數±標準差( ±s)表示。多個樣本均數比較採用完全隨機設計單因素方差分析，以P<0.05 為具有顯著性差異。
2、結果
2.1 不同干預措施對EPCs分泌MDA的影響(Table 3)
高濃度葡萄糖干預48 h後培養上清MDA水平高於正常對照組(P<0.05);應用ALA干預後與高糖組比較MDA水平下降(P<0.05)。
2.2 不同干預措施對EPCs GPx-1及eNOS表達的影響(Fig1-4，Table 1)
高糖干預48小時後 EPCs GPx-1及eNOS表達顯著低於對照組，而ALA干預後EPCs GPx-1及eNOS表達較高糖組顯著增加(P均<0.05)。
2.3 不同干預措施對EPCs GPx-1及eNOS mRNA表達的影響(Fig5-8，Table 2)
高糖干預48小時後 EPCs GPx-1及eNOS mRNA表達水平顯著低於對照組，而ALA干預後EPCs GPx-1及eNOS mRNA表達較高糖組顯著增加(P均<0.05)。
2.4 不同干預措施對EPCs分泌NO水平的影響(Fig9，Table 3)
高糖干預48小時後 EPCs分泌NO水平低正常對照組(P<0.05)，而ALA干預後EPCs eNOS表達較高糖組顯著增加(P <0.05)，培養上清NO水平升高。
3、討論
2004 年在美國糖尿病學會(American Diabetes Association, ADA) 年會上，Banting獎獲得者Brownlee做了演講：無論大血管還是微血管併發症都是同一發病機制,即高糖損傷的共同基礎---氧化應激的;同年歐洲糖尿病研究學會( European Association for the Study of Diabetes, EASD) 年會最高獎獲得者Ceriello發表演講,認為氧化應激是胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同發生機制---共同土壤學說。
EPCs是在迴圈外周血中存在的一種能分化為血管內皮細胞(EC)的前體細胞，它來源於骨髓、臍血或胎肝。在血管損傷或組織缺血的情況下 , 存在於骨髓中的EPCs可以應答於區域性釋放的生長因子和細胞因子而增殖，分化為成熟的內皮細胞，並動員至外周血液迴圈，特異性的歸巢於損傷或缺血部位，進一步增殖、分化為成熟的內皮細胞，參與血管新生和再內皮化。
一旦EPCs數量及功能受損，內皮損害和修復之間的平衡被打破，內皮層的完整性遭到破壞，由此發生動脈粥樣病變。因此內皮祖細胞對於調節內皮細胞凋亡/再生平衡及保持內皮層的完整性有著重要作用。所以EPCs的功能與糖尿病血管併發症的發生和發展密切相關，是心血管疾病的預測因子。
Dernbach等[6]檢測了健康成人EPCs的氧化敏感性，發現健康成人的EPCs細胞內ROS水平較低且氧化劑介導的凋亡較臍靜脈內皮細胞低，而且EPCs表面的抗氧化劑如錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、GSH-Px和CAT的表達較臍靜脈內皮細胞增加，說明健康人的EPCs較內皮細胞有更強的抗氧化能力;
從而促進了其生存能力，但這並不足以抵禦危險因素對EPC內源性抗氧化系統的影響，在高水平氧化應激情況下，EPCs內的氧化還原狀態失衡，導致細胞凋亡和衰老，從而損傷其功能。
血糖升高能通過PKC途徑啟用細胞內NADPH,生成大量活性氧族(ROS) ,損傷細胞,引起細胞正常生物活性下降,能量代謝、細胞訊號轉導及其他功能紊亂，也就是說，在高糖狀態可以誘發氧化應激。還有研究表明，高糖可通過氧化應激和P38MAPK途徑影響了EPCs的骨髓動員和存活率。
糖尿病患者和葡萄糖處理的EPCs造成NO的生物利用度降低或eNOS的輔基四氫生物蝶呤(BH4)下降，從而出現eNOS的解偶聯，產生超氧負離子(O-)，導致活性氧簇(ROS)的積聚，進一步使EPCs的數量及遷移能力降低。被氧化LDL介導的細胞的氧化應激在動脈硬化的發病機制中其關鍵性作用。
OxLDL通過促進EPCs衰老的而影響其功能是通過對EPCs eNOS的抑制作用來實現的，最近的研究，糖尿病患者ox-LDL通過P53介導的訊號途徑導致EPC功能失調，相反HDL由於其具有抗氧化和抗炎症的特性而被認為是血管功能的保護因子。
本研究應用高糖孵育大鼠骨髓源EPCs 48h，結果表明，培養上清中MDA水平顯著升高，說明高糖可導致EPCs產生氧化應激。Quagliaro 等的研究也提示,高濃度葡萄糖尤其是波動性高糖可通過二醯甘油及線粒體超氧陰離子的過度表達而活化蛋白激酶C(PKC) 通道,改變絲裂原活化蛋白激酶通路,促使細胞凋亡及DNA氧化損傷。
GPx-1是一個關鍵的氧化還原蛋白，它在保護內皮免受氧化應激的損傷從而保持血管環境穩定方面起著重要作用。研究表明，在離體頸動脈的斑塊GPx-1活性下降。還有研究表明，GPx-1過表達能夠使高濃度半胱氨酸培養的內皮細胞的血管內皮功能保持正常。
另外，還有研究表明缺乏GPx-1不僅會出現血管內皮功能失調，而且存在心臟和血管結構異常。另外，從GPx-1敲除小鼠分離的Ac-LDL+Lectin+ VEGFR-2+ eNOS+細胞無論體內還是體外都在促進血管發生方面存在功能缺陷並且存在對氧化應激敏感性增加[21]。C反應蛋白(CRP)干預EPCs後導致其糖基化終產物受體表達上調，使GPx-1及其它抗氧化酶表達下調，同時導致EPCs在體內的衰老和功能紊亂，進一步導致細胞凋亡增加。
eNOS是細胞色素P450 還原酶樣酶, 可催化黃素介導的從電子供體NADPH到亞鐵血紅素輔基的電子轉移。eNOS的輔基BH4 靠近亞鐵血紅素基, 可將電子傳遞到L精氨酸的胍基氮上從而產生NO。缺少L精氨酸或BH4時, eNOS會產生O2- 和H2O2 , 這個現象被稱為eNOS解偶聯。
eNOS在EPCs的動員與功能調控中發揮著至關重要的作用，eNOS解偶聯引起ROS水平升高從而造成EPCs功能受損。在糖尿病患者，eNOS解偶聯減少了糖尿病患者的EPC數量，降低了其功能，最終導致了血管疾病的發生。
有研究表明，eNOS是保證EPCs遷移能力的重要物質，eNOS基因敲除小鼠可導致EPCs遷移能力下降[25]，而保證eNOS的充分表達，保證NO的正常分泌及正常的生物活性是維持EPCs正常生物學功能的重要因素，本研究應用高濃度葡萄糖干預EPCs48h，發現EPCs的GPx-1蛋白表達及mRNA表達水平下降，同時存在eNOS蛋白表達mRNA表達及下調，NO分泌減少;
所以，本研究結果說明高糖除了可以使EPCs產生氧化應激之外還可以下調其抗氧化酶的表達，從而損傷其抗氧化能力，影響其功能。
ALA是一種天然抗氧化劑，它可以清除機體生理和病理過程中產生的各種自由基，減輕機體氧化應激。研究表明，ALA可以通過增加NO的活性，減少ROS的產生[26]，抑制NF-κB的表達,而改善大鼠血管內皮功能，還可以通過啟用內皮細胞AMPK途徑，逆轉高糖誘導的線粒體膜超極化作用，降低體內氧化應激水平。
本研究通過對高糖孵育的EPCs應用ALA進行干預，結果發現，EPCs的GPx-1及eNOS表達均上調，EPCs分泌NO增加，分泌MDA減少，說明ALA治療可以減輕高糖誘導的EPCs產生氧化應激，恢復其抗氧化能力，從而保護其功能。
總之，高濃度葡萄糖一方面可以誘發EPCs產生氧化應激，另一方面減少其抗氧化酶的生成與表達，損傷其抗氧化能力，而抗氧化應激治療可以改善EPCs的抗氧化能力及分泌NO能力。這提示我們，抗氧化應激治療對預防和治療糖尿病血管併發症的發生、發展具有一定意義。
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