現有的實驗方法較多，但特異性均差。膽道閉鎖時，血清總膽紅素增高，一分鐘膽紅素的比例亦相應增高。礆性磷酸酶的異常高值對診斷有參考價值。Υ-谷氨醯轉酶
高峰值高於300IU/L，呈持續性高水平或迅速增高狀態。5′核苷酸酶在膽管增生越顯著時水平越高，測定值>25IU/L，紅細胞過氧化氫溶血試驗方法較為複雜，若溶血在80％以上者則屬陽性。甲胎蛋白高峰值低於40μg/ml，其他常規肝功能檢查的結果均無鑑別意義。
對於黃疸的發病過程、糞便的色澤變化、腹部的理學檢查，應作追跡觀察，進行綜合分析。目前認為下列檢查有一定的診斷價值。
(一)血清膽紅素的動態觀察：每週測定血清膽紅素，如膽紅素量曲線隨病程趨向下降，則可能是肝炎;若持續上升，提示為膽道閉鎖。但重型肝炎並伴有肝外膽道阻塞時，亦可表現為持續上升，此時則鑑別困難。
(二)超聲顯象檢查：若未見膽囊或見有小膽囊(1.5cm以下)，則疑為膽道閉鎖。若見有正常膽囊存在，則支援肝炎。如能看出肝內膽管的分佈形態，則更能幫助診斷。
(三)99mTc-diethyl iminodiacetic acid(DIDA)排洩試驗：近年已取代131碘標記玫瑰紅排洩試驗，有較高的肝細胞提取率(48％～56％)，優於其他物品。可診斷由於結構異常所致的膽道部分性梗阻。如膽總管囊腫或肝外膽管狹窄，發生完全梗阻時，則掃描不見腸道顯影，可作為重症肝內膽汁鬱積的鑑別。在膽道閉鎖早期時，肝細胞功能良好，5分鐘顯現肝影，但以後未見膽道顯影，甚至24小時後亦未見腸道顯影。當新生兒肝炎時，雖然肝細胞功能較差，但肝外膽道通暢，因而腸道顯影。
(四)脂蛋白-X(Lp-x)定量測定：脂蛋白-X是一種低密度脂蛋白，在膽道梗阻時升高。據研究所有膽道閉鎖病例均顯升高，且在日齡很小時已呈陽性，新生兒肝炎病例早期呈陰性，但隨日齡增長也可轉為陽性。若出生已超過4周而Lp-X陰性，可除外膽道閉鎖;如>500mg/dl，則膽道閉鎖可能性大。亦可服用消膽胺4g/天，共2～3周，比較用藥前後的指標，如含量下降則支援新生兒肝炎綜合徵的診斷，若繼續上升則有膽道閉鎖可能。
(五)膽汁酸定量測定：最近應用於血紙片血清總膽汁酸定量法，膽道閉鎖時血清總膽汁酸為107～294μmol/L，一般認為達100μmol/L都屬鬱膽，同年齡無黃疸對照組僅為5～33μmol/L，平均為18μmol/L，故有診斷價值。尿內膽汁酸亦為早期篩選手段，膽道閉鎖時尿總膽汁酸平均為
19.93±7.53μmol/L，而對照組為1.60±0.16μmol/L，較正常兒大10倍。
(六)膽道造影檢查：ERCP已應用於早期鑑別診斷，造影發現膽道閉鎖有以下情況：①僅胰管顯影;②有時可發現胰膽管合流異常，胰管與膽管均能顯影，但肝內膽管不顯影，提示肝內型閉鎖。新生兒肝炎綜合徵有下列徵象：①胰膽管均顯影正常;②膽總管顯影，但較細。
(七)肝穿刺病理組織學檢查：
一般主張作肝穿刺活檢，或經皮肝穿刺造影及活檢。新生兒肝炎的特徵是小葉結構排列不整齊、肝細胞壞死、鉅細胞性變和門脈炎症。膽道閉鎖的主要表現為膽小管明顯增生和膽汁栓塞、門脈區域周圍纖維化，但有的標本亦可見到多核鉅細胞。因此，肝活檢有時能發生診斷困難，甚至錯誤，有10～15％病例不能憑此作出正確診斷。
總之，在生後1個月時，一旦高度懷疑為膽道閉鎖，就應進行多種的鑑別診斷方法，如臨床、實驗室、超聲、放射和組織切片等，外科探查也應考慮。對病程已接近2個月而診斷依然不明者，應作右上腹切口探查，通過最小的操作而獲得肝組織標本和膽道造影。如發現膽囊，作穿刺得正常膽汁，提示近測膽管系統未閉塞，術中造影確定遠端膽管系統。假如肝外膽管未閉寒，則作切取活檢或穿刺活檢，取自兩個肝葉以利診斷。如遇小而萎陷的膽囊得白色膽汁時仍應試作膽道造影，因新生兒肝炎伴嚴重肝內膽汁鬱積或肝內膽管缺如，均可見到癟縮的膽囊。如造影顯示肝外膽管細小和發育不良，但是通暢，則作活檢後結束手術。假如膽囊閉鎖或缺如，則解剖肝門區組織進行肝門腸管吻合術。
膽道閉鎖的典型病例，嬰兒為足月產，在生後1～2周時往往被家長和醫生視作正常嬰兒，大多數並無異常，糞便色澤正常，黃疸一般在生後2～3周逐漸顯露，有些病例的黃疸出現於生後最初幾天，當時誤診為生理性黃疸。糞便變成棕黃、淡黃、米色，以後成為無膽汁的陶土樣灰白色。但在病程較晚期時，偶可略現淡黃色，這是因膽色素在血液和其它器官內濃度增高而少量膽色素經腸粘膜進入腸腔摻入糞便所致。尿色較深，將尿布染成黃色。黃疸出現後，通常不消退，且日益加深，面板變成金黃色甚至褐色，可因搔癢而有抓痕，有時可出現脂瘤性纖維瘤，但不常見。個別病例可發生杵狀指，或伴有紫紺。肝臟腫大，質地堅硬。脾臟在早期很少捫及，如在最初幾周內捫及腫大的脾臟，可能是肝內原因，隨著疾病的發展而產生門靜脈高壓症。
在疾病初期，嬰兒全身情況尚屬良好，但有不同程度的營養不良，身長和體重不足。時常母親敘述嬰兒顯得興奮和不安，此興奮狀況可能與血清膽汁酸增加有關。疾病後期可出現各種脂溶性維生素缺乏現象，維生素D缺乏可伴發佝僂病串珠和闊大的骨骺。由於血液動力學狀況的改變，部分動靜脈短路和周圍血管阻力降低，在心前區和肺野可聽到高排心臟雜音。
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